一种定量检测D-二聚体的试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种定量检测D‑二聚体的试剂盒，包括：D‑二聚体校准品、包被有链亲和素的磁微粒、吖啶类衍生物标记的D‑二聚体的单克隆抗体、生物素标记D‑二聚体的单克隆抗体、化学发光底物和质控品。同时，试剂盒的制备方法包括：以D‑二聚体纯品原料配制校准品；制备吖啶类衍生物标记的抗体；制备生物素化抗体；以链亲和素包被磁微粒；分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；组装为成品。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测D-二聚体的试剂盒及制备方法
本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及一种定量检测D-二聚体的试剂盒及制备方法。
技术介绍
在止血与血栓过程中，凝血酶水解血浆纤维蛋白原形成纤维蛋白原单体，后者联接为纤维蛋白；同时凝血酶活化因子VIII，使纤维蛋白原交联；最后再纤溶酶的作用下，纤维蛋白降解成各种纤维蛋白降解产物（FDP）,其中最小片段为D-二聚体（D-dimer），分子量约为62KD，在体内半衰期约3h，主要经过肾脏排泄与网状内皮系统破坏。D-二聚体的生成反映机体凝血和纤溶系统的激活，在各种血栓形成性疾病以及生理性高凝集状态时D-二聚体的升高有关。D-二聚体与弥散性血管凝血：由致病因素激活凝血系统，导致血液在微血管内凝固，形成全身弥散性微血栓，凝血因子被大量激活、消耗并继发纤溶亢进，引起全身出血综合征；D-二聚体应用于监测溶栓治疗，D-二聚体测定可用于检测溶栓药物的疗效，动态观察D-二聚体量值的变化以便指导溶栓给药，评价治疗效果；D-二聚体与心脑血管病：D-二聚体的升高与动脉粥样硬化的发生和严重程度有关，心脏冠状动脉粥样硬化根据病情分为急性心肌梗死、稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛，其急性心肌梗死、不稳定性心绞痛病症中D-二聚体阳性检出率明显高于稳定性心绞痛。近20年来，D-二聚体的检测已成为多种心血管疾病的诊断和临床监测的必需指标。现有技术检测方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析法（GICA）、胶乳免疫比浊法(PETIA)。。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。但现有技术中对D-二聚体的检测方法一般都有各自的特点及不足：ELISA采用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性绫酸酶（AP）标记抗体，并催化底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析，试剂效期长，但ELISA的检测灵敏度较低，目前主要用于传染性疾病筛查；GICA是使用还原法将氯金酸制备各种不同粒径、不同颜色的胶体金颗粒，胶体金对蛋白质有很强的吸附功能可以与抗体进行非共价结合，金标试剂与待检物结合后，通过毛细作业在硝酸纤维素膜上向前移动，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便，多用于毒品检测，但线性范围较窄，可做定性或半定量检测，批间差异较大；胶乳免疫比浊法(PETIA)采用高分子胶乳微球比表面积大的特点与抗体交联，胶乳微球上的抗体与抗原在液相反应结合后，会迅速聚集在一起，改变反应液的散光性或透光性，即吸光度的改变与待检物的浓度有较强的相关性，在可限定的范围内反应待检物的浓度。胶乳试剂多与生化分析仪配套使用检测常规项目，容易实现自动化，待检物中脂类等内源性物质对浊度检测会产生干扰。现有技术在D-二聚体免疫分析产品的应用定量检测的技术存在灵敏度低，特异性差的缺点限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。
技术实现思路
本专利技术提供一种定量检测D-二聚体的试剂盒及制备方法，克服现有技术的灵敏度低，特异性差的缺点。一方面，本专利技术提供了一种定量检测D-二聚体(D-dimer)的试剂盒，本专利技术的试剂盒包括：1）D-二聚体校准品；2）包被有链亲和素的磁微粒；3）吖啶类衍生物标记的D-二聚体的单克隆抗体4）生物素标记D-二聚体的单克隆抗体；5）化学发光底物；6）质控品。另一方面，本专利技术提供了一种定量检测D-二聚体的试剂盒的制备方法，该方法包括：1)以D-二聚体纯品原料配制校准品；2)制备吖啶类衍生物标记的抗体；3）制备生物素化抗体；4)以链亲和素包被磁微粒；5)分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；6)组装为成品。在上述根据本专利技术的试剂盒及其制备方法中，所述载体还可以为固相载体、微孔板、塑料管或塑料珠；在其中一个实施例中，由于磁微粒的表面积大及结合蛋白能力强，所述载体为磁性微粒，所述磁微粒为粒径2.5～3μm，所述磁微粒的活性基团为氨基或羧基，所述磁微粒的使用浓度为10mg/mL。所述吖啶类衍生物标记物可以为吖啶酯，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸；在其中一个实施例中，标记物还可以为磺酸丙基吖啶酸-NHS酯所述化学发光底物A由H2O2和HNO3组成；所述化学发光底物B由聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）和NaOH组成。在根据本专利技术的方法中，其中所述步骤2）中的制备吖啶类衍生物标记的抗体可以包括以下过程：1）称取D-dimer单抗适量，使用0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液（CB）调正至1mg/mL；2）吖啶脂与抗体按照1:15摩尔计算，溶于二甲基甲酰胺（DMF），将两者混合，室温继续反应30分钟；3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）透析24小时;4）加入等体积甘油和体积比0.1％的生物防腐剂ProClin300（PC-300）。在根据本专利技术的方法中，其中所述步骤3）中的制备生物素化抗体可以包括以下过程：1）取适量抗D-二聚体（Anti‐D-dimer）单抗，0.01MpH7.2的PBS缓冲液透析纯化;2）加入15倍（摩尔比）已活化的长链磺化生物素（Sulfo‐NHS‐LC‐Biotin），2～8℃反应2小时，再转入室温继续反应30分钟3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01MpH7.2的PBS透析24小时;4）加入等体积甘油和体积比0.1％PC-300。在根据本专利技术的方法中，其中所述步骤4）中的以链亲和素包被磁微粒可以包括以下过程：1）取100mL0.05mol/L2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性微粒和3mg链酶亲和素;2）加入10mg/mL碳二亚盐酸盐溶液4μL，反应2小时，在磁场作用下移去上清液;3）加入0.01MpH7.2的PBS10mL，混匀，移去上清液;4）使用0.01MpH7.2的PBS重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。在本专利技术的过程中，专利技术人发现，D-二聚体抗体原料的筛选，对D-二聚体定量检测的灵敏度有较大影响；在本专利技术的其中一个实施例中，D-二聚体（D-dimer）不同配对的生物素化单克隆抗体和吖啶酯标记抗体，要求这些D-二聚体单克隆抗体，纯度不低于90％；其中，生物素化单克隆抗体浓度为0.4μg/mL，低或高于于此浓度，会使D-二聚体定量检测的灵敏度偏低；在本专利技术的过程中，专利技术人发现，D-二聚体定量检测使用的双抗体夹心一步法的反应模式和反应条件最终也会影响试剂盒。本专利技术“D-二聚体化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人D-二聚体的含量，可以根据D-二聚体含量，实现多种心血管疾病的诊断和临床监测。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本专利技术的试剂盒，吖啶脂标记的D-二聚体单抗与载体上包被的D-二聚体单抗和被测样品的D-二聚体抗原形成双抗体夹心的结构，因此本专利技术采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。进一步地，本专利技术中对试剂盒的制备方法进行了改良，改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测D‑二聚体的试剂盒，其特征在于，包括：D‑二聚体校准品、包被有链亲和素的磁微粒、吖啶类衍生物标记的D‑二聚体的单克隆抗体、生物素标记D‑二聚体的单克隆抗体、化学发光底物和质控品。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测D-二聚体的试剂盒，其特征在于，包括：D-二聚体校准品、包被有链亲和素的磁微粒、吖啶类衍生物标记的D-二聚体的单克隆抗体、生物素标记D-二聚体的单克隆抗体、化学发光底物和质控品。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为粒径2.5～3μm，所述磁微粒的活性基团为氨基或羧基，所述磁微粒的使用浓度为10mg/mL。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述吖啶类衍生物标记物为吖啶酯、吖啶酮类化合物、吖啶磺酰胺类化合物、吖啶基氨基乙酸或磺酸丙基吖啶酸-NHS酯。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物由化学发光液A和化学发光液B组成：所述化学发光液A由质量分数1.6%的H2O2和浓度为0.1mol/L的HNO3组成；所述化学发光液B由浓度为0.1mol/L的TritonX-100和0.36mol/L的NaOH组成。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液，用于稀释生物素化抗体、吖啶类衍生物标记的抗体、链亲和素包被磁微粒，所述缓冲液包括：0.01-0.1MpH7.8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、体积比5%的鼠血清、质量比0.5-2mg/mL羊免疫球蛋白G、质量比0.1%-5%的海藻糖、质量比0.5%-1%的酪蛋白钠盐和体积比0.2%的生物防腐剂ProClin300。6.一种定量检测D-二聚体的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：1）以D-二聚体纯品原料配制校准品；2）制备吖啶类衍生物标记的抗体；3）制备生物素化抗体；4）以链亲和素包被磁微粒；5）分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；6）组装为成品。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述制备吖啶类衍生物标记的抗体包括以下过程：1)称取D-二聚体单抗适量，使用0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液调正至1mg/mL；2)吖啶脂与抗体按照1:15摩尔计算，溶于二甲基甲酰胺，将两者混合，室温继续反应30分钟；3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志强，胡国富，朱炎，
申请(专利权)人：浙江艾明德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33