母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用制造技术

本发明专利技术公开一种母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用，属于基因工程和细胞工程技术领域。本发明专利技术以MMP2基因为研究对象，采用了细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中的表达应用。本发明专利技术第一次证实猪MMP2基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达情况；以及在猪卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰MMP2后，对母猪卵巢颗粒细胞的影响；在颗粒细胞中MMP2基因启动子缺失片段的活性。

【技术实现步骤摘要】
母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用
本专利技术属于基因工程和细胞工程
，具体涉及一种母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2(雌二酮)生成的应用。
技术介绍
卵巢是哺乳动物重要的生殖腺，是卵泡发育和排卵的重要繁殖器官。卵泡作为卵巢的基本组成单位，维持着卵子的存在、发育与闭锁。颗粒细胞是卵泡周围扁平或立方状细胞，其生长与分化在卵泡的发育过程中起着重要的调控作用。卵泡的发育过程伴随着颗粒细胞生长、发育和分化，颗粒细胞的增殖和凋亡与卵泡发育卵母细胞的成长发育、原始卵泡生长的启动、生长期卵泡发育的调控以及卵泡闭锁密切相关。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是一类重要的锌离子水解酶，主要功能是降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)，调节细胞粘着，可以作用于细胞外成分或其它蛋白成分而启动潜在的生物学功能，直接或间接参与胚胎发育、角膜修复、骨生长、组织重塑、血管形成及创伤愈合等正常生理过程以及炎症、肿瘤的侵袭转移等病理过程。迄今在人类至少已发现有种之多,构成MMPs超家族。依据MMPs各成员均有特异的底物将其分为五类：(1)胶原酶，其作用底物主要为间质胶原；(2)明胶类，其作用底物主要是Ⅳ型胶和明胶；(3)基质溶胶，可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、型胶原和基质中的蛋白多糖和糖蛋白，并能激活某些MMP；(4)模型胶，能降解几种ECM成分，有些可激活其他MMP；(5)其它类，较复杂，有些底物不详。组织金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)是其天然抑制物两者在肿瘤发生过程中起着重要的作用。MMP2是MMPs家族的重要成员，定位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子所组成，它不仅能水解变性胶原及细胞外基底膜中的主要成分Ⅳ型胶原，MMP2表达和功能的调节发生于转录、分泌、前酶原的激活、细胞表面的结合以及与来源于肿瘤或宿主细胞的抑制剂的相互作用等多个不同的水平。MMP2在肿瘤细胞的增殖、血管生成、浸润转移中有重要作用，除了降解基底膜型胶原外，还可以分解多种重要的生物活性分子结合蛋白，使生物活性分子游离而发挥作用。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。本专利技术的另一目的在于提供抑制MMP2基因的RNA小干扰片段(siRNA)。本专利技术的另一目的在于提供所述的MMP2基因的核心启动子区。本专利技术的再一目的在于提供所述的MMP2基因的核心启动子区的应用。通过基因工程技术构建该基因启动子区的缺失片段，分析各启动子区缺失片段的活性，找出其核心启动子区。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。过表达MMP2基因后能促进E2的生成，干扰MMP2基因后抑制E2的生成。本专利技术提供一种抑制MMP2基因的siRNA，序列如下：MMP2-siRNA-2：5′-GCGACAAGAAGUACGGCUU-3′；MMP2-siRNA-3：5′-GCAAACAGGACAUCGUCUU-3′；本专利技术提供一种MMP2基因的核心启动子区，其位置位于-1145～-686bp区域。本专利技术的验证结果如下：1、构建含有MMP2基因CDS区的真核表达载体pcDNA3.1-MMP2，qRT-PCR检测超表达MMP2基因后MMP2基因的表达情况。2、合成3对MMP2基因干扰小片段/对照(MMP2-siRNA/Scrambled-siRNA)，筛选并检测其干扰效率。3、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰MMP2基因，用FITCAnnexinVApoptosisDetectionKitwithPI检测细胞凋亡。4、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰MMP2基因，用ELISA检测卵巢颗粒细胞上清中E2的含量。5、构建含有MMP2基因启动子区缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体，瞬时转染进猪的卵巢颗粒细胞，双荧光素酶报告系统分析MMP2基因启动子区缺失片段的活性，并确定其核心启动子区。本专利技术以MMP2基因为研究对象，采用了分子与细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中表达调控。关键点在于：(1)检测MMP2基因在各组织中的表达情况；(2)超表达或者干扰母猪MMP2基因，对母猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响；(3)超表达或者干扰母猪MMP2基因，对母猪卵巢颗粒细胞上清中E2水平的影响；(4)构建含有MMP2基因启动子区缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体并进行启动子活性分析找出核心启动子区。本专利技术的机理是：本专利技术主要通过qRT-PCR检测长大二元杂母猪MMP2基因在母猪各个组织上的表达情况，构建含有MMP2基因CDS区序列的真核表达载体，并合成三对MMP2基因的siRNA，通过qRT-PCR检测MMP2基因的超表达和干扰情况，通过流式细胞仪检测超表达或者干扰MMP2基因对母猪卵巢颗粒细胞的影响，并使用ELISA试剂盒检测超表达或者干扰MMP2基因后母猪卵巢颗粒细胞上清中E2的浓度变化，随后使用PCR技术获得母猪MMP2基因启动子区序列，构建含有MMP2基因启动子区缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体，瞬时转染进猪的卵巢颗粒细胞，双荧光素酶报告系统分析MMP2基因启动子区缺失片段的活性，并确定其核心启动子区。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术以MMP2基因为研究对象，采用了细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中的表达应用。本专利技术第一次证实猪MMP2基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达情况；以及在猪卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰MMP2后，对母猪卵巢颗粒细胞的影响；在颗粒细胞中MMP2基因启动子缺失片段的活性。附图说明图1是猪MMP2基因，在各组织中的表达情况图。图2是qRT-PCR检测MMP2基因在卵巢颗粒细胞中的最适转染浓度图。图3是qRT-PCR检测MMP2基因3对干扰小片段的干扰效率图。图4是超表达或者干扰MMP2基因后E2的水平变化图。图5是MMP2基因启动子缺失片段的活性分析图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1卵巢颗粒细胞的培养(1)在屠宰场采集卵巢，用PBS或者生理盐水(含1％双抗)置于37℃保温瓶迅速运回实验室；(2)将收集的卵巢在无菌培养室用预热过的PBS(含1％双抗)清洗3遍后，迅速转入超净工作台；用1mL无菌一次性注射器浅插入卵巢有腔卵泡中吸取卵泡液；(3)吸取的卵泡液置于含有适量DMEM的15mL离心管中，1000rpm室温离心6min；(4)弃去上清，再用DMEM重悬、离心，重复清洗细胞2次；配制DMEM完全培养基：89％DMEM+10％FBS+1％双抗；(5)吸取细胞重悬液和完全培养基接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。所述的双抗为青霉素和链霉素。实施例2卵巢颗粒细胞的接种和转染(1)颗粒细胞长至90％左右，倒掉培养基，用预热的含1％双抗(所述的双抗为青霉素和链霉素)的PBS洗3遍；(2)加入胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。

【技术特征摘要】
1.一种母猪MMP2基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制MMP2基因的siRNA，其序列如下：MMP2-siRNA-2：5′-GCGACAAGAAGUACGGCUU-3′。3.根据权利要求1所述的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓龙，辛晓萍，张豪，钟玉宜，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44