一种用于培养人脂肪干细胞的培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种用于培养人脂肪干细胞的培养基，该培养基由如下组分组成：DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、还原型谷胱甘肽、亚油酸、青霉素，链霉素，L‑谷氨酰胺，碱性成纤维细胞生长因子，维生素C和植物提取多肽组成。本发明专利技术的培养基具有培养速度，细胞保持较好的完整性和活性。该培养基能够用于大规模的细胞培养，成本低廉方便配制。

【技术实现步骤摘要】
一种用于培养人脂肪干细胞的培养基
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种人脂肪干细胞的培养基。
技术介绍
脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69％，S期占24％，G2/M期占8％。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15％。由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此，对于细胞培养基的需求非常强烈。目前常用的ADSCs培养是利用饲养层细胞与采用含10％胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢，更要紧的是使用饲养层细胞和动物血清容易导致干细胞污染，特别是动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒将对人体健康构成极大地风险，这样培养出的干细胞不适于直接应用于临床。因此，开发一种合适的有效的培养基变得迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人脂肪干细胞培养基，克服使用血清制备细胞培养基的缺点和风险。大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵,是构成动物细胞培养生产成本的主要部分之一。本专利技术提供一种特别适合于人脂肪干细胞培养基，该培养基由如下组分组成：DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、还原型谷胱甘肽、亚油酸、青霉素，链霉素，L-谷氨酰胺，碱性成纤维细胞生长因子，维生素C和植物提取多肽组成。其中，各组分的具体用量分别为青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素C50μg/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL、还原型谷胱甘肽浓度为10μg/mL、亚油酸浓度为5μg/mL，植物提取多肽30μg/ml。本专利技术另外提供一种培养人脂肪干细胞的方法，包括将人脂肪干细胞加入到所述的人脂肪干细胞培养基进行培养的步骤。本专利技术另外提供一种获得植物多肽，该多肽从天然植物川西喜冬草中提取，川西喜冬草常绿小草本状半灌木，其叶片稍肥厚有光泽，申请人推测其就有较强的耐逆和抗旱抗氧化的功效。申请人通过分离该植物叶片通过制备蛋白库功能分析发现，该植物提取的多肽具有稳定人脂肪干细胞，促进干细胞生长，保持干细胞正常生长状态的功效。本专利技术另外提供一种获得植物多肽的方法，(1)将川西喜冬草叶片清洗干净，绞碎，榨汁，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量15000IU/g叶片，酶解温度45℃，pH值7.0，酶解时间2h，酶解完成后92℃灭酶13min；(2)灭酶后的物料过滤除去不溶物，得到溶液，所得多肽溶液加入4％活性炭吸附脱色，用葡聚糖G-50(SephadexG-50)进行多肽分离，20mmol/LHCl溶液洗脱，流速1.3mL/分钟，分别收集不同时间段的洗脱产物，调节溶液至pH7.0，10000转/分钟离心15分钟，经大孔树脂DA201-C脱盐处理后，真空浓缩，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，回收小分子量的条带，其中经过功能验证，共得到27个小肽的序列具有促进细胞生长的功能。根据色谱柱中不同的峰值分离时间，可以批量获得相应的小肽，也可人工合成所述的多肽。所述多肽的序列如SEQIDNO：1-27所示。分别命名为CXXDC-1～27。该培养基提供结合蛋白、多肽类物质、维生素参与细胞代谢，可以起到供应营养、中和、解毒的效果。该培养基不含动物血清，不含动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒，方便应用于临床。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。实施例1:不加多肽的培养基配制1)制备预定量1000mL,取900mL高糖型DMEM细胞培养液(厂家:Sigma)，加入青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素C50μg/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL、还原型谷胱甘肽10μg/mL、亚油酸5μg/mL。2)调pH值:用5％NaHCO3调节pH到7.0，用DMEM细胞培养液定容到1000ml。3)过滤除菌:采用0.45um和0.22um滤膜各一张,上层为0.45um,下层为0.22um,以保证过滤效果。实施例2多肽的提取将川西喜冬草叶片清洗干净，绞碎，榨汁，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量15000IU/g叶片，酶解温度45℃，pH值7.0，酶解时间2h，酶解完成后92℃灭酶13min；灭酶后的物料过滤除去不溶物，得到溶液，所得多肽溶液加入4％活性炭吸附脱色，用葡聚糖G-50(SephadexG-50)进行多肽分离，20mmol/LHCl溶液洗脱，流速1.3mL/分钟，分别收集不同时间段的洗脱产物，调节溶液至pH7.0，10000转/分钟离心15分钟，经大孔树脂DA201-C脱盐处理后，真空浓缩，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，回收小分子量的条带，其中经过功能验证，共得到27个小肽的序列具有稳定人脂肪干细胞，促进干细胞生长，保持干细胞正常生长状态的功效。根据色谱柱中不同的峰值分离时间，可以批量获得相应的小肽，也可人工合成所述的多肽。所述多肽的序列如SEQIDNO：1-27所示。分别命名为CXXDC-1～27。实施例3含有多肽的培养基的配制1)制备预定量1000mL,取900mL高糖型DMEM细胞培养液(厂家:Sigma)，加入青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素C50μg/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL、还原型谷胱甘肽10μg/mL、亚油酸5μg/mL，CXXDC-1多肽30μg/ml。2)调pH值:用5％NaHCO3调节pH到7.0，用DMEM细胞培养液定容到1000ml。3)过滤除菌:采用0.45um和0.22um滤膜各一张,上层为0.45um,下层为0.22um。制备得到的培养基为CXXDC-1培养基。按照上述相同的方法，分别制备CXXDC-2～27的培养基。实施例4本专利技术培养基与常规有血清培养基培养与效果的比较将1X106个的脂肪干细胞分别接种到30组盛有不同的培养基的直径100mm培养皿中，每组10个培养皿，混匀；其中第一组-第27组分别有10个培养皿，加入CXXDC-2～27的培养基5mL；第28组10个培养皿，加入培养基mTeS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于人脂肪干细胞培养的培养基，该培养基在高糖型DMEM细胞培养液的基础上加入青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L‑谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素C 50μg/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL,还原型谷胱甘肽10μg/mL,亚油酸5μg/mL和多肽30μg/ml组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于人脂肪干细胞培养的培养基，该培养基在高糖型DMEM细胞培养液的基础上加入青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素C50μg/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，
申请(专利权)人：李倩，
类型：发明
国别省市：江苏,32