一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体及制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体及制备方法与应用。本发明专利技术首先培养幽门螺旋杆菌，提取幽门螺旋杆菌脂多糖；将幽门螺旋杆菌脂多糖和佐剂混合制成抗原，对蛋鸡进行初次免疫和加强免疫，加强免疫共计3～5次；从第一次加强免疫开始，收集鸡蛋，分离，得到抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体。应用本发明专利技术制得的抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体添加于食品或制备成保健食品，可用于辅助防治因幽门螺杆菌感染引起的胃溃疡或胃癌；亦可制成药品，用于防治因幽门螺杆菌感染引起的胃溃疡或胃癌。

Yolk antibody against Helicobacter pylori lipopolysaccharide and preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to an egg yolk antibody against Helicobacter pylori lipopolysaccharide, a preparation method and application thereof. The invention firstly cultures Helicobacter pylori and extracts the lipopolysaccharide of Helicobacter pylori; mixes the lipopolysaccharide of Helicobacter pylori and adjuvant to make antigen, carries on the first immunization and strengthens the immunity to the laying hens, strengthens the immunity totally 3-5 times; from the first time strengthens the immunity, collects the egg, separates, obtains the anti-Helicobacter PY Yolk antibodies of polysaccharides. The egg yolk antibody prepared by the invention is added to food or prepared into health food, which can be used to assist in preventing and treating gastric ulcer or gastric cancer caused by Helicobacter pylori infection, and can also be made into medicine for preventing and treating gastric ulcer or gastric cancer caused by Helicobacter pylori infection.

【技术实现步骤摘要】
一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体及制备方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体及制备方法与应用。
技术介绍
幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)是科学家BarryMarshall和RobinWarren发现的，该菌能够感染胃部组织并且引发溃疡，而这两位研究者也因发现了幽门螺杆菌而获得了2005年的诺贝尔生理学及医学奖。幽门螺旋杆菌，又称幽门螺杆菌，是胃溃疡和胃癌的致病因子。据估计，一半的世界人口感染上幽门螺旋杆菌。很多感染者产生胃炎症状，而且每5名感染者当中，就有1人在他们的生命的某个时刻患上胃溃疡，在很多情形下，这是一种病情进展快速的致命性疾病。胃炎和胃溃疡可利用抗生素加以治疗；这些治疗经常需要使用两到三种不同类型的抗生素，而且仍然不能够治愈所有的病人。在最糟糕的情形下，长期的幽门螺旋杆菌炎症能够导致胃癌产生。胃癌是一种高度致死性的很难治疗的癌症。在全世界，胃癌每年影响着100万人，每年有超过70万人死于胃癌。日前，来自西澳大学等多个机构的研究人员通过研究深入阐明了幽门螺杆菌重要生物分子的精细结构，该菌是诱发机体胃溃疡的重要致病菌，相关研究刊登于国际杂志PLoSPathogens上，研究人员表示，他们深入解析了负责幽门螺杆菌脂多糖产生的酶类及其结构，特殊的脂多糖分子就好像一个保护盾一样能够覆盖到整个细菌细胞表面，相比其它细菌而言其有着一定的特性，脂多糖能够帮助细菌入侵机体天然的免疫系统来诱发长期的感染。利用幽门螺杆菌脂多糖免疫产蛋母鸡，使母鸡体内产生抗体，并产生在蛋黄内含有抗体的鸡蛋。该产品是鸡在反复摄取幽门螺杆菌脂多糖抗原后，当鸡体内产生抗体时产下的蛋。鸡蛋中的蛋黄中就存在抗幽门螺杆菌脂多糖的抗体。该抗体可以对抗幽门螺杆菌的内毒素，阻止幽门螺杆菌吸附到胃黏膜上，预防其入侵机体天然的免疫系统和诱发相应的感染，对于胃溃疡和胃癌有预防和治疗作用。
技术实现思路
为了克服现有技术的的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体，该抗体机理明确，可安全、有效地预防胃溃疡和胃癌的抗幽门螺杆菌脂多糖。本专利技术的再一目的在于提供上述幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的制备方法，包含如下步骤：培养幽门螺旋杆菌，提取幽门螺旋杆菌脂多糖；将幽门螺旋杆菌脂多糖和佐剂混合制成抗原，对蛋鸡进行初次免疫和加强免疫，加强免疫共计3～5次；从第一次加强免疫开始，收集鸡蛋，分离，得到抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体；所述的幽门螺旋杆菌脂多糖的制备方法，包含如下步骤：(1)将幽门螺旋杆菌菌苔洗涤后，用水混悬，反复冻融至菌体裂解，得到裂解液；将裂解液与质量分数为90％的苯酚溶液分别预热至67.5～68.5℃后混合，67.5～68.5℃剧烈搅拌30～60min，得到混合液；将混合液冰浴至4℃以下，离心，得到酚相；(2)步骤(1)制得的酚相加等体积无热原水洗涤，收集水相透析去除苯酚；浓缩；然后加入DNase和RNase酶解，沸水浴使酶失活，冷却后离心，弃沉淀，收集上清，加入丙酮沉淀，得到幽门螺旋杆菌脂多糖；步骤(1)中所述的幽门螺旋杆菌菌苔，通过下述方法制备得到：幽门螺杆菌采用ECY无血培养基在微需氧环境下培养，灭菌生理盐水洗下生长良好的菌苔，得到抗幽门螺旋杆菌苔；步骤(1)中所述的洗涤优选为采用生理盐水洗涤3～5次；步骤(1)中所述的水的用量优选为3～5倍菌苔体积；步骤(1)中所述的反复冻融的条件优选为-20℃以下及20～40℃冻融5～6次；步骤(1)中所述的苯酚溶液与裂解液的体积比优选为1:1；步骤(2)中所述的洗涤的次数优选为2～3次；步骤(2)中所述的透析的具体操作优选为：收集水相装于透析袋中，流水透析12h去酚，再用注射用水透析60h；步骤(2)中所述的浓缩优选为采用质量分数为50％的聚乙二醇6000浓缩，浓缩后的体积优选不超过原体积的1/4；步骤(2)中所述的酶解的条件优选为DNase和RNase在体系中的终浓度为30～50μg/mL，36.5～37.5℃酶解4～8h；步骤(2)中所述的失活的条件优选为沸水浴加热10～30min；步骤(2)中所述的冷却优选为冷却至20～40℃；步骤(2)中所述的丙酮的用量优选为上清2倍体积；所述的免疫的具体操作优选为：选取20周龄产蛋母鸡；初次免疫使用弗氏完全佐剂和幽门螺旋杆菌脂多糖等体积混合，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射；初次免疫两周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂和脂多糖等体积混合，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫3～5次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋；所述的幽门螺旋杆菌脂多糖的初始浓度优选为0.5～1mg/mL；所述的注射的用量为每只母鸡注射0.5mL；所述的分离的具体操作优选为：分离所收集的鸡蛋的卵黄，加入无水乙醇脱水，减压干燥得到粗品抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体，或者将卵黄进一步纯化，得到成品抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体；所述的纯化的具体操作优选为：(1)用6～9倍卵黄体积的水溶解稀释卵黄，20～40℃搅拌30min～2h，得到溶解液；然后加入硅藻土和0.6～1.3倍溶解液体积的乙醇，调节pH至6.5～7.5，搅拌30min～1h，过滤弃去残渣，得到清液；(2)向步骤(1)制得的清液中加入硅藻土和1.5～2.5倍溶解液体积的乙醇，调节pH值至5.0～5.4，搅拌30min～1h，过滤弃去上清液，得到固体组分；在固体组分中加入6～9倍固体组分质量的水溶解，20～40℃搅拌30min～2h，过滤弃去残渣，得到清液；(3)将步骤(2)制得的清液超滤浓缩，干燥，得到抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体；步骤(1)中所述的卵黄的收集优选为：将鸡蛋清洗消毒后打破，用蛋黄分离器小心分离卵黄；步骤(1)中所述的硅藻土的用量为按溶解液计终浓度5～20g/L；步骤(2)中所述的硅藻土的用量为按溶解液计终浓度5～20g/L；步骤(1)和步骤(2)中所述的乙醇优选为预先冷却至0～15℃的乙醇；步骤(3)中所述的超滤浓缩优选为用超滤器进行超滤浓缩，浓缩倍数为3～5倍，或加入PBS进行超滤；步骤(3)中所述的干燥优选为冷冻干燥；一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体通过上述制备方法制备得到；所述的抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体在制备预防或治疗胃溃疡和胃癌产品中的应用；所述的产品优选为食品添加剂、保健品或药品；一种酸奶，包含上述抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体；所述的酸奶的制备方法，包含如下步骤：(1)将奶粉120～130g和上述粗品抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体或成品抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体5～10g混合，然后加入70℃～80℃，940～1060mL温开水，得到乳液；(2)均质：将步骤(1)制得的乳液9～11MPa均质1～2min；(3)灭菌：将步骤(2)中均质后的乳液在88～92℃的水浴保温9～10min进行杀菌处理，然后将其冷却至38～42℃，得到料液；(4)接种：在无菌条件下，将发酵剂按照1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包含如下步骤：培养幽门螺旋杆菌，提取幽门螺旋杆菌脂多糖；将幽门螺旋杆菌脂多糖和佐剂混合制成抗原，对蛋鸡进行初次免疫和加强免疫，加强免疫共计3～5次；从第一次加强免疫开始，收集鸡蛋，分离，得到抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体。

【技术特征摘要】
1.一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包含如下步骤：培养幽门螺旋杆菌，提取幽门螺旋杆菌脂多糖；将幽门螺旋杆菌脂多糖和佐剂混合制成抗原，对蛋鸡进行初次免疫和加强免疫，加强免疫共计3～5次；从第一次加强免疫开始，收集鸡蛋，分离，得到抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体。2.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的幽门螺旋杆菌脂多糖的制备方法，包含如下步骤：(1)将幽门螺旋杆菌菌苔洗涤后，用水混悬，反复冻融至菌体裂解，得到裂解液；将裂解液与质量分数为90％的苯酚溶液分别预热至67.5～68.5℃后混合，67.5～68.5℃剧烈搅拌30～60min，得到混合液；将混合液冰浴至4℃以下，离心，得到酚相；(2)步骤(1)制得的酚相加等体积无热原水洗涤，收集水相透析去除苯酚；浓缩；然后加入DNase和RNase酶解，沸水浴使酶失活，冷却后离心，弃沉淀，收集上清，加入丙酮沉淀，得到幽门螺旋杆菌脂多糖。3.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的免疫的具体操作为：选取20周龄产蛋母鸡；初次免疫使用弗氏完全佐剂和幽门螺旋杆菌脂多糖等体积混合，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射；初次免疫两周后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂和脂多糖等体积混合，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫3～5次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋。4.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的幽门螺旋杆菌脂多糖的初始浓度为0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，肖益热，郑希，王甜甜，陈莉莉，贺攀，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44