一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用技术

一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用，包括油茶粉脱脂除皂素后，经热水提取无水乙醇沉淀，沉淀物冻干后，再依次经过DEAE Sepharose F.F.离子交换柱、Sephadex G‑100凝胶过滤柱、AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G‑75凝胶柱进行分离纯化，得到分子量为25 kDa的油茶活性糖蛋白；然后采用化学法和/或酶法对该糖蛋白进行构效改造。本发明专利技术的方法能够高效的实现糖蛋白的制备及其构效改造，改造后油茶糖蛋白的活性功能发生显著变化，有的被赋予了更高的活性，这为糖蛋白构效关系的解析提供了有效的技术途径。

A structural modification of Camellia oleifera active glycoprotein and its preparation and Application

A structure-activity modification active glycoprotein of Camellia oleifera and its preparation method and application are described. The glycoprotein is extracted by hot water and precipitated by anhydrous ethanol. The precipitate is then lyophilized and then passed through DEAE Sepharose F.F. ion exchange column, Sephadex G_100 gel filtration column, AKTA SuperdexTM G_7 protein separation and purification apparatus. The active glycoprotein of Camellia oleifera with molecular weight of 25 kDa was isolated and purified by gel column, and its structure and activity were modified by chemical and/or enzymatic methods. The method of the invention can efficiently realize the preparation of the glycoprotein and its structure-activity modification, and the active function of the glycoprotein of Camellia oleifera changes remarkably after the modification, and some of the glycoproteins are endowed with higher activity, which provides an effective technical way for the analysis of the structure-activity relationship of the glycoprotein.

【技术实现步骤摘要】
一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及食品生物
，具体涉及一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
油茶(CamelliaoleiferaAbel.)为山茶科(Theaceae)山茶属植物，以产出油茶籽油而著称，是我国特有的优良木本油料植物，同时它也是兼具油料、饲料、医药、化工、观赏等功效为一体的多用途植物。传统医学所记载的油茶具有清热解毒，活血散瘀，止痛等功效，现代研究报道表明油茶含有皂素、多糖、黄酮等丰富的活性成分，具有调节免疫力、调节血脂和血糖、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等多种活性功能和药用价值，但目前油茶的开发利用主要途径是作为油料作物提取油脂，其他功能尚未被重视，这种优质的多用途资源的开发利用途径尚显单一。糖蛋白广泛存在于生物体内，是由肽链和糖链通过共价键结合而形成的大分子。近年来的研究发现，存在于植物中的糖蛋白具有极大的利用价值，除了具有凝聚素、结构蛋白、酶、贮藏蛋白和毒素等方面的作用，众多文献还报道许多植物来源的糖蛋白具有增强免疫、消炎、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、降血糖、抗辐射等活性功效，目前在临床上早已应用的重组蛋白药物几乎全是糖蛋白，如必思添、乌司他丁以及万古霉素等。从细胞信号传导、蛋白质折叠、受体结合、激素调节、免疫识别到生物半衰期的调控等方面也均能发现糖蛋白的踪迹。尤其是在抗肿瘤方面，由于植物糖蛋白的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物靶向性的集中到病灶，正常组织的生长和免疫系统的功能却不受干扰，从而减少不良反应。糖蛋白所具有的重要生理功能和应用价值，引发众多学者的积极探索，但糖蛋白研究起步较晚，糖蛋白结构复杂，兼有糖类和蛋白类的结构特点，结构已经研究透彻的糖蛋白数量屈指可数。目前根据糖链的连接位点，有N-连接糖蛋白、O-连接糖蛋白、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI)和C-连接糖蛋白。由于不同糖蛋白肽链和糖链各自的特异性和多样性，以及不同糖蛋白肽链和糖链链接的复杂性，其结构信息丰富多变，目前对糖蛋白的构效改造一直是个难题，尤其在糖蛋白的结构特征、功能活性、作用机理以及构效关系等未知领域有众多问题亟待解决。专利技术人前期研究发现油茶中也含有活性糖蛋白，通过系列细胞试验以及动物体内实验均表明该油茶糖蛋白具有良好的抗肿瘤和抗氧化活性，然而对于油茶糖蛋白的结构和功能活性的构效关系尚未阐明，尤其是糖蛋白中糖基化位点与其活性功能的关系，糖链在糖蛋白活性功能中的权重，在细胞或分子水平上的机理研究依旧空白，油茶糖蛋白的精细量化利用还缺乏有效、广泛的数据支持。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术针对现有技术的空白，提供一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用，本专利技术提出糖蛋白构效关系研究的新途径，即通过结构改造将糖蛋白上的糖链进行部分或全部切除，促使其原始活性发生升高或降低的变化，从而为糖蛋白的构效解析提供依据。本专利技术提供了油茶糖蛋白中糖链结构改造的方法和过程，并对结构改造的变化进行验证，同时考察油茶糖蛋白结构改造前后抗氧化活性和抗肿瘤活性的变化，探索出工艺条件更合理、效率更高的油茶糖蛋白构效改造方法。技术方案：一种构效改造的油茶活性糖蛋白的制备方法，制备步骤为：(1)油茶活性糖蛋白的制备：油茶粉碎后经石油醚脱脂，再用体积分数为90％的乙醇除去皂素，干燥后备用；将干燥后产物，按液料比为20mL/g在60-95℃条件下加水提取1-3h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为70％-90％，离心后将沉淀进行冷冻干燥，得干燥物；干燥物溶于0.01-0.05mol/LTris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液pH为8且含0.02mol/LNaCl，用DEAESepharoseF.F.离子交换柱进行分离纯化，收集经0.2-0.5mol/LNaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用SephadexG-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTMG-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25kDa的油茶活性糖蛋白；(2)油茶活性糖蛋白的构效改造：采用化学法和/或酶法改造，所述化学法是添加三氟甲基磺酸(TFMS)或高碘酸(NaIO4)进行结构改造；所述酶法是添加PNGaseF酶、EndoH酶或O-糖苷酶中的任意一种进行结构改造。使用三氟甲基磺酸时，称取10-100mg的油茶活性糖蛋白样品，加入50-500μLTFMS，-20℃条件下反应0.5-2h，加入150-1500μL甲醇，放入冰水浴中30min，加入5-50mL5％wt.碳酸氢铵搅拌，蒸馏水透析，冷冻干燥，完成油茶糖蛋白结构改造过程。使用高碘酸时，称取10-100mg的油茶活性糖蛋白样品加入1-10mL浓度为0.1-0.3mmol/LNaCl溶液，4℃下避光过夜；用0.1mol/L醋酸调节溶液pH至4.5，加入预冷的200mmol/LNaIO4，使得其最终浓度为50-100mmol/L，4℃下反应5h；随后加入总体积1/2量的100mmol/L碳酸氢钠，并用1mol/LNaOH调节pH至9-10.5，4℃下静置反应1h；用1-3mmol/L碳酸氢钠缓冲液进行透析过夜，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥，完成油茶糖蛋白结构改造过程。上述酶法是：称取20-100μg的油茶糖蛋白样品，加入1-5μL糖蛋白变性缓冲液以及9-25μL蒸馏水，使其在温度为100℃加热反应10min，，所述糖蛋白变性缓冲液为0.5wt.％SDS含40mMDTT，冷冻离心后加入2-10μL50mMpH6的醋酸钠、2-10μL10％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、5-25μL蒸馏水以及1-10μL酶，在37℃下培养0.5-2h，经SephadexG-75凝胶过滤柱去除酶，即得到结构改造的油茶糖蛋白。上述制备方法制得的构效改造的油茶活性糖蛋白。上述构效改造的油茶活性糖蛋白在制备促进原有油茶糖蛋白抗氧化活性产品中的应用。上述构效改造的油茶活性糖蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。采用SDS-PAGE电泳、高效液相凝胶过滤色谱(HP-GPC)、傅里叶红外光谱等方法考察不同处理对油茶糖蛋白结构改造的变化。采用ABTS自由基清除能力测定法、DPPH自由基清除能力测定法以及超氧阴离子清除能力测定法，对结构改造前后油茶糖蛋白的抗氧化功能进行了考察；采用MTT法，对结构改造前后油茶糖蛋白的体外抗肿瘤活性进行了考察，评价其构效改造的效果。有益效果：本专利技术提出以改变糖蛋白中糖链的方式，改造其结构的方法进行糖蛋白的相关研究。由于不同的结构改造方法会产生复杂的空间构象变化，进而会引起油茶糖蛋白分子生物学功能发生变化，通过对油茶糖蛋白的糖链进行不同的处理，比较糖链改造前后、不同的改造方法的油茶糖蛋白，其对应的抗氧化和抗肿瘤活性功能上所发生的变化，有助于更全面地解析油茶糖蛋白的构效关系。本专利技术提供高效优化的构效改造方法、作用条件和过程，以制备所得的油茶活性糖蛋白为载体，进行结构的改造，考察不同改造方法处理后其在抗氧化和抗肿瘤活性功能的变化，为糖蛋白的构效解析提供参考。附图说明图1油茶糖蛋白经酶法改造后SDS-PAGE电泳图，其中A：考马斯亮蓝染色；B：糖蛋白PAS-Schiff染色。泳道1、2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构效改造的油茶活性糖蛋白的制备方法，其特征在于制备步骤为：（1）油茶活性糖蛋白的制备：油茶粉碎后经石油醚脱脂，再用体积分数为90%的乙醇除去皂素，干燥后备用；将干燥后产物，按液料比为20 mL/g在60‑95℃条件下加水提取1‑3h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为70%‑90%，离心后将沉淀进行冷冻干燥，得干燥物；干燥物溶于0.01‑0.05mol/L Tris‑HCl缓冲液，所述Tris‑HCl缓冲液pH为8且含0.02mol/L NaCl，用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，收集经0.2‑0.5 mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用Sephadex G‑100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G‑75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25 kDa的油茶活性糖蛋白；（2）油茶活性糖蛋白的构效改造：采用化学法和/或酶法改造，所述化学法是添加三氟甲基磺酸（TFMS）或高碘酸（NaIO4）进行结构改造；所述酶法是添加PNGase F酶、Endo H酶或O‑糖苷酶中的任意一种进行结构改造。...

【技术特征摘要】
1.一种构效改造的油茶活性糖蛋白的制备方法，其特征在于制备步骤为：（1）油茶活性糖蛋白的制备：油茶粉碎后经石油醚脱脂，再用体积分数为90%的乙醇除去皂素，干燥后备用；将干燥后产物，按液料比为20mL/g在60-95℃条件下加水提取1-3h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为70%-90%，离心后将沉淀进行冷冻干燥，得干燥物；干燥物溶于0.01-0.05mol/LTris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液pH为8且含0.02mol/LNaCl，用DEAESepharoseF.F.离子交换柱进行分离纯化，收集经0.2-0.5mol/LNaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用SephadexG-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTMG-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25kDa的油茶活性糖蛋白；（2）油茶活性糖蛋白的构效改造：采用化学法和/或酶法改造，所述化学法是添加三氟甲基磺酸（TFMS）或高碘酸（NaIO4）进行结构改造；所述酶法是添加PNGaseF酶、EndoH酶或O-糖苷酶中的任意一种进行结构改造。2.根据权利要求1所述构效改造的油茶活性糖蛋白的制备方法，其特征在于使用三氟甲基磺酸时，称取10-100mg的油茶活性糖蛋白样品，加入50-500μLTFMS，-20℃条件下反应0.5-2h，加入150-1500μL甲醇，放入冰水浴中30min，加入5-50mL5%wt.碳酸氢铵搅拌，蒸馏水透析，冷冻干燥，完成油...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婷婷，徐云巧，吴彩娥，范龚建，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32