用于产生经纯化重组霍乱毒素B（rCTB）的新方法及其制剂技术

本发明专利技术涉及用于产生经纯化重组霍乱毒素B(recombinant cholera toxin B，rCTB)的新方法，所述经纯化重组霍乱毒素B提供针对由多种细菌例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和肠致病性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的腹泻的保护。更特别地，本发明专利技术涉及以显著更高产量和更高纯度产生rCTB的方法。本发明专利技术还涉及具有针对霍乱弧菌的协同保护和针对ETEC的交叉保护的疫苗制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)的新方法及其制剂
本专利技术涉及用于产生经纯化重组霍乱毒素B(recombinantcholeratoxinB，rCTB)的新方法，所述经纯化重组霍乱毒素B提供针对由多种细菌例如霍乱弧菌(Vibriocholerae)和肠致病性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)引起的腹泻的保护。更特别地，本专利技术涉及用于以显著更高产量和更高纯度产生rCTB的方法。本专利技术还公开了针对霍乱弧菌和肠致病性大肠杆菌(ETEC)的经纯化rCTB的疫苗制剂，其当与全细胞灭活霍乱菌株一起配制时具有协同作用。
技术介绍
腹泻性疾病是对公共健康的持续存在的全球威胁。腹泻的主要原因包括某些细菌、病毒或寄生虫、食物不耐性等。婴幼儿和成人腹泻的主要原因之一是霍乱弧菌。霍乱弧菌是一种革兰氏阴性菌，其定殖于小肠而不侵入上皮并且引起急性肠霍乱感染。尽管已经鉴定出霍乱弧菌的多于200个血清组，但是霍乱的大多数情况是由两个血清组O1和O139引起的。当霍乱弧菌细菌通过受污染的食物或饮用水被摄取时引起疾病。仅影响人的霍乱是由霍乱毒素(choleratoxin，CT)介导的，霍乱毒素由霍乱弧菌在肠中分泌并且作用于肠的黏膜细胞，引起多种可以导致严重脱水和休克的无痛性水样腹泻。如果不进行治疗的话，可能在数小时内发生死亡。据估计，每年28,000至142,000例的死亡率和每年140万至430万例的患病率可以归因于霍乱。其作为由自然或人为灾难引起的流行病发生，并且在许多发展中国家也是地方病。在这样的灾难中和在地方病国家中，干净的饮用水和合适的环境卫生是不能获得的并且因此疫苗的介入变得必不可少。在2010年，WHO建议将经口霍乱疫苗与其他控制措施一起在地方病国家中使用和用于霍乱流行二者皆可[Cholera–factsheetN107.WorldHealthOrganization.2012,pp.Cholera–factsheetN107]。目前有三种通过WHO初审的灭活经口霍乱疫苗可供使用：1.其包含全细胞组分和重组霍乱毒素B-亚基(rCTB)；和2.其缺乏rCTB但除O1血清组之外还包含O139血清组的霍乱弧菌菌株。公知的是，包含rCTB的灭活全细胞疫苗比没有rCTB的灭活全细胞疫苗提供更好的保护。由于抗CTB抗体与热不稳定性肠毒素(heatlabileenterotoxin，LTB)的交叉反应性，包含rCTB的灭活全细胞疫苗(Dukoral)对肠致病性大肠杆菌(ETEC)同样有效[LucasM.E,DeenJ.L,VonSeidleinL,WangX.Y,AmpueroJ,PuriM,AliM,AnsaruzzamanM,AmosJ,MacuamuleA等.‘EffectivenessofmassoralcholeravaccinationinBeira,Mozambique.’N.Engl.J.Med.2005,352,757–767.]。Shanchol缺乏rCTB组分并且因此缺乏例如短期ETEC交叉保护、协同保护作用(抗细菌+抗毒性免疫)、早期和长期保护等的益处。因此，在经口霍乱疫苗中包含rCTB是更好的。rCTB是酸不稳定的，因此Dukoral疫苗必须在施用疫苗之前向其施加75mL至150mL碳酸氢盐缓冲剂，这使得对于5岁以下的儿童和甚至对于成人而言施用在逻辑上是困难的。此外，在Dukoral中，必须打开所述缓冲剂袋并使内容物溶解在所需量的水中，之后添加并混合来自玻璃小瓶的疫苗。该附加剂量制备步骤使该疫苗使用起来不方便且麻烦。在经口霍乱疫苗中添加rCTB可以导致疫苗的成本增加，如从Dukoral/Shanchol的比较中显而易见的，其中Dukoral每剂量定价为超过$45，而Shanchol每剂量定价为$5。其中可以使包含rCTB的经口霍乱疫苗更具成本效益的一种方式是通过开发以下这样的方法用于rCTB发酵和纯化：其使用简单且有效的纯化方法提供高培养物OD和高rCTB产量。有许多涉及rCTB的产生和纯化的专利和非专利公开内容。文章“RecombinantsystemforoverexpressionofcholeratoxinBsubunitinVibriocholeraeasabasisforvaccinedevelopment”PNAS,1989,第86卷,第481-485页中的非专利公开内容公开了通过使用亲和色谱柱获得的最佳产量为75μg/ml，这从生产的角度来看并不具有成本效益。另一篇题为“CholeraToxinB:OneSubunitwithManyPharmaceuticalApplications,”Toxins2015,7,974-996的非专利公开了迄今为止用于rCTB产生的表达系统的模式和所使用纯化方法的详尽列表。该数据显示，到目前为止还没有实现超过1gm/Lt的rCTB产量。鉴于以上现有技术，本领域中的实际贡献将是开发实现显著更高产量以及高纯度的产生和纯化重组霍乱毒素B的方法。此外，需要开发热稳定，消除对缓冲剂施用的需求并且使疫苗递送容易的制剂和剂型。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供用于产生经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)的新方法。本专利技术的另一个目的是提供以显著高产量和高纯度获得经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)的发酵和纯化方法。本专利技术的另一个目的是提供用于通过简单且有效的方法进行rCTB的发酵和纯化以在非常短的时间内获得经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)同时消除不期望杂质的方法。本专利技术的另一个目的是提供用于产生经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)的可放大规模、耗时较短、具有成本效益、环境友好且可负担的方法。本专利技术的另一个目的是提供能够用于针对霍乱弧菌的新疫苗制剂的经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)。本专利技术的另一个目的是提供能够用于经口霍乱疫苗的新疫苗制剂，其提供针对霍乱弧菌的早期、长期和协同保护以及针对ETEC的交叉保护。专利技术概述因此，本专利技术提供了用于以显著更高产量和更高纯度产生经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)的新方法。用于产生rCTB的本专利技术方法可放大规模、耗时较短且环境友好，因为细菌菌株在发酵罐中灭活并且因此污染环境的可能性最低。本专利技术还涉及rCTB与灭活全细胞霍乱弧菌的疫苗制剂和以适于患者顺从性的热稳定剂型提供所述制剂。本专利技术的方法在下文作为一个非限制性实例公开：组成型或诱导型过表达rCTB的重组O1霍乱弧菌菌株是由瑞典哥德堡大学(GothenbergUniversity,Sweden)JanHolmgren教授的实验室制备的并且用于在预定培养基上制备主细胞库和工作细胞库。在本专利技术中，在维持在预定条件下的发酵罐中对所述选定菌株进行发酵。发酵培养基包含葡萄糖进料和其他已知的生产培养基组分。在维持预定pH和温度的同时，使发酵罐运行18至22小时。通过加热至预定温度范围对所得发酵培养物进行灭活，以获得包含灭活细胞、变性蛋白和rCTB的收获物。将收获物在室温下以预定rpm离心。对所得上清液进行酸沉淀和超滤以产生经纯化rCTB。对如此获得的滤出物进一步进行渗滤，随后进行无菌过滤以产生经纯化且经灭菌的rCTB。对所得经纯化且经灭菌的rCTB进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于从霍乱弧菌(Vibrio cholerae)产生经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)以获得新疫苗制剂的新方法，所述方法包括以下步骤：‑进行rCTB发酵以获得发酵培养物；‑对发酵培养物进行热灭活以获得收获物；‑纯化所述收获物以获得经纯化rCTB；其中所述方法可在工业上放大规模、具有成本效益并且以高纯度获得高产量的经纯化rCTB。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.14 IN 4089/DEL/20151.用于从霍乱弧菌(Vibriocholerae)产生经纯化重组霍乱毒素B(rCTB)以获得新疫苗制剂的新方法，所述方法包括以下步骤：-进行rCTB发酵以获得发酵培养物；-对发酵培养物进行热灭活以获得收获物；-纯化所述收获物以获得经纯化rCTB；其中所述方法可在工业上放大规模、具有成本效益并且以高纯度获得高产量的经纯化rCTB。2.如权利要求1所述的方法，其中所述产量为1.5至2.5gm/升并且所述纯度高于95％(＞95％)。3.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵步骤包括以下步骤：(a)在预定条件下，使选定的霍乱弧菌菌株在发酵罐中；(b)在预定pH和预定温度下运行所述发酵罐预定持续时间以获得发酵培养物。4.如权利要求3所述的方法，其中所述预定条件是将1M葡萄糖进料添加到rCTB培养基中。5.如权利要求3所述的方法，其中所述预定pH为7.2至7....

【专利技术属性】
技术研发人员：塔伦·夏尔马，尼拉伊·乔希，维布胡·干乍，迪帕·西克里瓦尔，尼迪·舒克拉，达温德·吉尔，
申请(专利权)人：默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司，
类型：发明
国别省市：印度,IN