改良的表达蛋白质的菌株制造技术

本发明专利技术提供一种改良的用于产生期望的蛋白质的宿主菌株。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改良的表达蛋白质的菌株对相关申请的引用本申请要求2015年12月22日提交的美国临时专利申请第62/270762号、和2016年1月14日提交的美国临时专利申请第62/278728号的提交日的权益。本申请还要求2016年1月27日提交的欧洲专利申请第16152977.1号的提交日的权益。以上参考的申请中的每个的全部内容都并入本文以供参考。对序列表的引用本申请包含纸质和计算机可读形式的序列表。纸质和计算机可读形式的序列表是说明书的一部分或另外并入本文以供参考。专利
本专利技术主要涉及一种以基本上高于亲本菌株的水平表达蛋白质的真菌菌株的开发。
技术介绍
大约30年来，期望的异源蛋白质已经在微生物中制备。尽管已经引入必要的编码序列并获得了表达，然而为了优化商业生产的过程还有很多工作要做。一个感兴趣的领域涉及菌株改良，即寻找或制造宿主微生物的菌株，例如其允许以更高的产量或更好的纯度制备蛋白质。为了增加产量，一旦已设计了良好的表达系统，可能设想增加编码序列的拷贝数，或者增加mRNA的数量或稳定性，或者改善蛋白质的折叠和/或分泌，或者降低蛋白质的降解。然而，只有当以限制因子为靶标时才能看到期望的表达增加的效果。因此，需要的是允许期望的蛋白质如异源蛋白质的产量增加的宿主菌株。本专利技术人已经令人惊讶地鉴定了NOT4(也称为MOT2)的突变导致这样的产量增加。Not4是一种泛素连接酶，并且是Ccr4-Not复合物的一部分。Ccr4-Not复合物在真核细胞中是保守的，并且在酵母中复合物由9个核心亚基组成：Ccr4、Caf1、Caf40、Caf130、Not1、Not2、Not3、Not4和Not5(Collart，2003，GlobalcontrolofgeneexpressioninyeastbytheCcr4–Notcomplex.Gene313:1-16；Bai等,1999,TheCCR4andCaf1proteinsoftheCcr4–NotcomplexarephysicallyandfunctionallyseparatedfromNot2,Not4,andNot5.Mol.Cell.Biol.,19:6642-6651)。已提议将该复合物作为中央交换机，其可以解释来自环境的信号并协调所有基因的表达水平以经济地响应信号(Collart，2012，TheCcr4-Notcomplex.Gene492(1):42-53)。据认为Not4蛋白质(Not1、Not2、Not3、Not4)是装配RNA聚合酶II复合物所必需的，这表明其在转录调节中具有全局性的作用(Collart，1994，Not1(cdc39),Not2(cdc36),Not3,andNot4encodeaglobal-negativeregulatoroftranscriptionthatdifferentiallyaffectstata-elementutilization.Genes&Development8(5):525-537；Collart，2012，如上引用)。最近，共晶体结构表明Not4的C-末端区域如何环绕Not1(Ccr4-Not复合物中的支架蛋白)的HEAT-重复区域(Bhaskar，2015，ArchitectureoftheubiquitylationmoduleoftheyeastCcr4-Notcomplex.Structure23(5):921-8)。
技术实现思路
本专利技术提供一种真菌宿主细胞，其具有：a.修饰的Not4蛋白质或其同系物，或者b.修饰的Not4蛋白质或其同系物的活性水平，或者c.修饰的NOT4基因或其同系物，或者d.修饰的NOT4基因或其同系物的表达水平。本专利技术还提供一种真菌宿主细胞的培养物，该真菌宿主细胞包含编码期望的蛋白质如异源蛋白质的多核苷酸序列，其特征在于该真菌宿主细胞具有降低的Not4蛋白质或其同系物的活性水平。本专利技术进一步提供一种用于从真菌宿主细胞制备期望的蛋白质如异源蛋白质的方法。本专利技术提供一种用于改变来自真菌宿主细胞的期望的蛋白质的产量的方法。本专利技术还提供一种期望的蛋白质，如异源蛋白质。白蛋白或其变体、片段、和/或融合物是优选的期望的蛋白质。本专利技术进一步提供一种组合物，如药物组合物，其包含期望的蛋白质。本专利技术还提供一种治疗患者的方法，其包括向患者施用有效量的组合物。本专利技术进一步提供一种制备真菌宿主细胞的方法。本专利技术还提供Not4蛋白质或其同系物，其包含与SEQIDNO:2至少70％的同一性以及在对应于选自SEQIDNO:2的一个或多个以下位置的位置处的突变：426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469或470。本专利技术进一步提供编码本专利技术的Not4变体的多核苷酸。本文所述的任何实施方式(包括仅在实施例和/或优选的实施方式部分中描述的那些)意在能够与任何其它实施方式组合，除非明确否认或组合不合适。附图说明图1是示出20个氨基酸的分类及其之间的关系的文氏图。图2示出质粒pDB5438的构建体。图3示出质粒pDB2244的构建体，“rHA”意指重组人白蛋白，“FL”是前导序列。图4示出质粒pDB2305的构建体，“mFL”是前导序列。图5示出质粒pDB3029的构建体，“Inv”是前导序列。图6示出质粒pDB5912的构建体，“mFL”是前导序列。图7示出质粒pDB3936的构建体，“mFL”是前导序列。定义白蛋白：术语“白蛋白”是指与人血清白蛋白(HSA)或HSA结构域具有相同和/或非常相似的三级结构并具有与HSA或相关结构域相似的性质的蛋白质。类似的三级结构例如是来自在亲本白蛋白下提及的种类的白蛋白的结构。白蛋白的一些主要性质是：i)调节血浆容量的能力(肿胀活性oncoticactivity)，ii)约19天±5天的长血浆半衰期，iii)与gp60(也称为清蛋白激活蛋白(albondin))结合，iv)与FcRn结合，v)配体结合，例如内源性分子如酸性、亲脂性化合物(包括胆红素、脂肪酸、氯化血红素和甲状腺素)的结合(也参见Kragh-Hansen等，2002，Biol.Pharm.Bull.25,695的表1，在此并入本文以供参考)，vi)具有酸性或电负性特征的小有机化合物的结合，例如药物如华法林、地西泮、布洛芬和紫杉醇(也参见Kragh-Hansen等，2002，Biol.Pharm.Bull.25,695的表1，在此并入本文以供参考)。并非所有这些性质都需要满足，以表征蛋白质或片段为白蛋白。例如，如果片段不包含负责结合某些配体或有机化合物的结构域，则预计这种片段的变体也不具有这些性质。等位基因变体：术语“等位基因变体”是指占据相同染色体位点的基因的两种或多种替代形式中的任何一种。等位基因变体通过突变自然产生，并可能导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或者本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.真菌宿主细胞，其具有a.修饰的Not4蛋白质或其同系物，或者b.Not4蛋白质或其同系物的修饰的活性水平，或者c.修饰的NOT4基因或其同系物，或者d.NOT4基因或其同系物的修饰的表达水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.27 EP 16152977.1;2015.12.22 US 62/270,762;1.真菌宿主细胞，其具有a.修饰的Not4蛋白质或其同系物，或者b.Not4蛋白质或其同系物的修饰的活性水平，或者c.修饰的NOT4基因或其同系物，或者d.NOT4基因或其同系物的修饰的表达水平。2.根据权利要求1所述的真菌宿主细胞，其中修饰的水平是降低的水平。3.根据权利要求2所述的真菌宿主细胞，其中所述降低的水平是相对于参照真菌宿主细胞的水平，所述参照真菌宿主细胞比如Not4蛋白质包含SEQIDNO:2或者由SEQIDNO:2组成的真菌宿主细胞。4.根据权利要求1-3中任一项所述的真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主是酵母或丝状真菌。5.根据前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其包含编码期望的蛋白质的核苷酸序列，所述期望的蛋白质如异源蛋白质，如血清蛋白，优选白蛋白或者其变体、片段和/或融合物。6.根据前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中所述Not4蛋白质在对应于选自SEQIDNO:2的426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469或470位置的位置处，优选选自429、430、434、或437位置的位置处包含突变。7.根据权利要求6所述的真菌宿主细胞，其中在对应于SEQIDNO:2的位置429的位置处的突变是取代为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选取代为G、A、V、L或I，更优选取代为I、L或V，最优选取代为I。8.根据权利要求6所述的真菌宿主细胞，其中在对应于SEQIDNO:2的位置429的位置处的突变是F429I。9....

【专利技术属性】
技术研发人员：P·拉迈亚，C·J·A·芬尼斯，J·M·麦克劳克兰，P·K·诺德戴德，
申请(专利权)人：阿尔布梅迪克斯医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB