检测食品中产气荚膜梭菌和tpel基因的引物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测食品中产气荚膜梭菌和tpel基因的引物、试剂盒和方法，该引物的序列和探针序列分别为:上游引物recAF；下游引物recAR；探针recAP；上游引物tpelF；下游引物tpelR；探针tpelP；本发明专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddPCR检测食品中产气荚膜梭菌及tpel的试剂盒；本发明专利技术另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测食品中产气荚膜梭菌及tpel的方法，该方法操作简便、快速，检测结果准确。

Primers, kits and methods for detection of Clostridium perfringens and tpel genes in foods

The present invention discloses a primer, kit and method for detecting Clostridium perfringens and tpel genes in food. The sequence and probe sequence of the primer are: upstream primer recAF; downstream primer recAR; probe recAP; upstream primer tpelF; downstream primer tpelR; probe tpelP; the purpose of the present invention is to overcome the existing technology. The invention provides a primer with reasonable composition and proportion, convenient use, rapid and accurate detection, suitable for detection of Clostridium perfringens and tpel in food by double dd-PCR; another object of the invention is to provide a method for detection of Clostridium perfringens and tpel in food by using the primer kit. The method is simple, rapid and accurate.

【技术实现步骤摘要】
检测食品中产气荚膜梭菌和tpel基因的引物、试剂盒和方法
本专利技术涉及一种检测食品中产气荚膜梭菌和tpel基因的引物，本专利技术还涉及一种包含上述引物用于检测食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的双重微滴式数字PCR(ddPCR)检测试剂盒，本专利技术还涉及一种采用上述试剂盒检测食食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种属于梭菌属的革兰氏阳性菌，具有荚膜，可产生芽孢，不具有运动性。C.perfringens是引起人畜共患病的主要病原菌之一，该菌的致病因子是其所产生的外毒素。目前，已发现C.perfringens产生的外毒素多17种，并以α型、β型、ε型和ι型4种毒素最为常见；C.perfringens还会产生其他多种毒素或者潜在的致毒因子，如肠毒素(CPE)。根据所产毒素的不同，C.perfringens可分为5种类型。由C.perfringens导致的食物中毒多与水、肉和禽肉制品相关。调查美国1998―2010年由C.perfringens引起食物中毒的结果显示，肉类食品占食物总量的92％，其中牛肉制品占46％，禽肉制品占30％，猪肉制品占16％。据报道，生鲜牛肉、猪肉、火鸡肉和鸡肉及各种肉制品中C.perfringens检出率均超过10％，部分日本鸡肉中检出率甚至高达84％。以往检测细菌数量较多使用都是16sRNA。但是，然而随着研究的深入,16SrRNA基因也表现出了不容忽视的缺点:高保守性使其不能很好的区分亲缘关系较近的物种；在基因组内的多拷贝性使确定其序列的准确性降低。因此在进行更精确地分类鉴定和以及计算细菌某个毒力基因拷贝数时就很难确定。为弥补16SrRNA基因的缺点,人们开始尝试使用其他不同的看家基因(如recA基因等)进行放线菌的分子生物学分析。recA是原核生物同源重组的中心分子,为单拷贝基因，在DNA重组和DNA损伤应急修复(SOS)过程中是一个关键的基因,常用于做细菌分型。本专利技术将其作为产气荚膜梭菌的看家基因作为其分子鉴定基因，同时开展双重数字PCR检测其他毒力基因，从而不仅有效确定菌肿，而且还可以对毒力基因含量进行一个评估。Tpel经鉴定为大小为206ku，该蛋白在产气荚膜梭菌生长过程中分泌的由蛋白酶将其降解成为两段。与已知的艰难梭菌的大梭菌细胞毒素，索氏梭菌的致命毒素和诺维氏梭菌α毒素有非常高的同源性。蛋白质序列含有DXD短保守序列，是酶活性的一个非常重要的氨基酸残基，许多糖基转移酶家族都有这段保守序列，该序列被认为在锰离子依赖性糖基转移酶和二磷酸糖核苷与碳水化合物结合过程中发挥重要作用。Tpel蛋白还可以引起小鼠和细胞的致死作用。与免疫鸡血清有很强的免疫反应，可能说明其在的免疫方面有着一定的作用。由于产气荚膜梭菌属于厌氧菌，其培养要求较高,需要特殊的厌氧培养条件和设备,加上还需要采取特殊采样方式、应用相应培养基、鉴定试剂等,一般的实验室难以开展对该菌的研究,故长期以来国内对厌氧菌及其在食物中毒中的作用也缺少认识。在政府和民众重视食品安全的今天,对食品中厌氧菌的危险性应该进行评估。常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且不可能实现定量检测。目前，Southernblot和实时荧光定量PCR是常用的两种外源基因拷贝数分析技术，已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，Southernblot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差。荧光定量PCR(qRT-PCR)在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响。微滴数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，它基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。通过将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的基因拷贝数。针对产气荚膜梭菌recA及tpel基因的检测就未见报道。本专利技术基于微滴式ddPCR平台，建立了产气荚膜梭菌看家基因recA及tpel基因拷贝数分析方法，研究结果为分析食品安全生物源性风险因子的定量检测提供了新方法，也为食品安全质量控制提供了一个新手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddPCR检测食品中产气荚膜梭菌及tpel的试剂盒；本专利技术另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测食品中产气荚膜梭菌及tpel的方法，该方法操作简便、快速，检测结果准确。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案:一种食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的引物，其特征在于该引物的序列和探针序列分别为:上游引物recAF:tgggagattctcacgttggtc下游引物recAR:gcttgcttaaatggaggagca探针recAP:acaacaccaggtggtagagcgt上游引物tpelF:gcctaagttaaaacaagaaagccct下游引物tpelR:tcctacaggcaaatccaggc探针tpelP:tgcagcatttattatacctgcagcca一种ddPCR检测食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0μL反应体系包括以下组分:其中2×ddPCRSuperMix10.0μL，产气荚膜梭菌和tpel上、下游引物各1.0μL、探针各1.0μL，DNA模板4.0μL。一种ddPCR检测产气荚膜梭菌及tpel基因的方法，其特征在于包括以下步骤:A、提取样品DNA；B、将各反应组分加入上述20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；C、将产生的微滴细全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应。D、打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每PCR反应管中微滴的PCR反应情况,最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。如上所述检测产气荚膜梭菌及tpel的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行:(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性10s，57.5℃退火1min，共进行40个循环；(3)98℃酶热失活10min；(4)4℃停止反应。如上所述检测产气荚膜梭菌及tpel基因的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下:采用核酸纯化旋转离心柱分离法,适用于纯菌液及分泌物中细菌DNA的提取。操作步骤按细菌模板提取试剂盒说明书进行。本专利技术中敏感性和特异性试验:采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的参考菌株基因组DNA加入前述反应体系，重复试验显示检测样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的引物，其特征在于该引物和探针组合的序列分别为:上游引物recAF:tgggagattctcacgttggtc下游引物recAR:gcttgcttaaatggaggagca探针recAP:acaacaccaggtggtagagcgt上游引物tpelF:gcctaagttaaaacaagaaagccct下游引物tpelR:tcctacaggcaaatccaggc探针tpelP:tgcagcatttattatacctgcagcca

【技术特征摘要】
1.一种检测食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的引物，其特征在于该引物和探针组合的序列分别为:上游引物recAF:tgggagattctcacgttggtc下游引物recAR:gcttgcttaaatggaggagca探针recAP:acaacaccaggtggtagagcgt上游引物tpelF:gcctaagttaaaacaagaaagccct下游引物tpelR:tcctacaggcaaatccaggc探针tpelP:tgcagcatttattatacctgcagcca2.一种检测食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的数字PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0μL反应体系包括以下组分:其中2×ddPCRSuperMix10.0μL，上、下游引物各1.0μL、探针各1.0μL，DNA模板4.0μL。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的上游引物recAF与上游引物tpelF的用量比例为0.1-1:1。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述的下游引物recAR与下游引物tpelR的含量比例为0.1-1:1。5.一种检测食品中产气荚膜梭菌及tpel基因的方法，其特征在于包括以下步骤:A、提取样品DNA；B、将各反应组分加入如权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冰，蔡先全，张宪臣，邱德义，
申请(专利权)人：蔡先全，
类型：发明
国别省市：广东,44