一种用于减小数字聚合酶链式反应中由光学假象引起的量化误差的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法及一种用于以dPCR确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法。

A method for reducing quantization errors caused by optical artifacts in digital polymerase chain reaction

The present invention relates to a method for reducing quantization errors caused by optical artifacts in digital polymerase chain reaction (dPCR) and a method for determining the amount or concentration of nucleic acids of interest in a sample by dPCR.

【技术实现步骤摘要】
一种用于减小数字聚合酶链式反应中由光学假象引起的量化误差的方法专利
本专利技术涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法及一种用于以dPCR确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法。专利技术背景对于许多生物学，生物化学，诊断或治疗目的，必须准确和精确测定样品中核酸的量或浓度。dPCR是一种较新的核酸检测和量化办法，为用于核酸绝对量化和罕见等位基因检测的常规实时定量PCR提供备选方法。dPCR如下起作用，即将核酸的样品分配入许多单独的，平行的PCR反应；这些反应中的有些含有(阳性的)而有些不含(阴性的)靶分子。在PCR分析后，使用阴性反应的分数来生成该样品中靶分子的数目的绝对计数。dPCR胜过实时PCR的关键优势之一是它卓越的量化准确度。这种优势依赖于dPCR的内在特性，因为量化仅仅需要阳性分区的正确计数和理论分配体积的知识(计数数目对PCR效率并非非常灵敏)。不需要量化标准。这消除由标准自身引起的潜在量化误差。现有技术提供方法用于在基于小滴的测定法中鉴定不正确的阳性或阴性计数及校准或标准化信号(US2013/0302792A1)。这种标准化应当改善阳性和阴性计数之间的分离。因此，标准化减小假阳性或阴性计数的风险。最终目标是通过校正为核酸获得的信号来改善核酸浓度测定的准确度和精确度。然而，现有技术的方法没有考虑PCR中由于光学测定受到假象损害的情形所致的量化误差。因而，需要减小由光学假象引起的量化误差的，通过dPCR量化感兴趣核酸的方法。本专利技术的目标是提供那些方法。通过基于数字聚合酶链式反应(dPCR)的方法解决了该问题，其中分析每个反应区域中光学信号的分布并自感兴趣核酸的量或浓度的计算排除具有光学假象的反应区域。专利技术概述因而，本专利技术提供一种高度准确和精确的通过dPCR量化核酸的方法，其容许更加精确和准确地测定样品中感兴趣核酸的量或浓度。特别是，上述方法容许排除例如由于反应区域中的杂质(例如污垢)或任选测量中的技术失败而具有光学假象的反应区域。专利技术详述在第一个方面，本专利技术涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法，其中在反应区域的阵列中量化感兴趣核酸的量或浓度，该方法包括a)提供dPCR中使用的反应区域的阵列；b)测定每个反应区域中光学信号的分布；c)如果步骤b)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效；并d)自该感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。如上文详述地，可靠测定核酸的量或浓度的方法在数个产业应用中，例如在医药领域中特别重要。对于数个方面，可能不仅必须澄清样品中是否存在核酸，而且可能需要–尽可能精确和准确地–测定样品，例如自患者或产品获得的样品中核酸的量或浓度。例如在疾病严重程度的诊断中或在环境技术或产品的质量控制中，例如为了限定污染或杂质，这可能是感兴趣的。本dPCR方法聚焦于确定预定体积中存在的核酸数目且不考虑光学假象。dPCR(数字聚合酶链式反应或数字PCR)是常规聚合酶链式反应方法的一种生物技术精化，它可用于直接量化和任选克隆性扩增核酸，包括DNA，cDNA，RNA或其混合物。dPCR和传统PCR(例如qPCR)之间的关键差异在于测量核酸量的方法，前者是比PCR更加精确和准确的方法，尽管在没有经验的使用者的手中也更加倾向于误差。dPCR的更小动力学范围可能需要稀释样品。dPCR也在一份样品内进行单个反应，然而该样品分拆成大量的分区或反应区域且单独地在每个分区或反应区域中进行反应。这种分拆容许对核酸量的更加可靠收集和灵敏测量。此外，该方法容许准确量化。如上文详述地，对dPCR样品进行分配，使得样品内的核酸分子个体在许多分开的区域(反应区域)内定位和浓缩。通过假设分子群体遵循泊松(Poisson)分布，样品的分配容许估算核酸的数目。结果是，每个部分会含有一个阴性或阳性反应(分别为“0”或“1”)。在PCR扩增后，通过对含有PCR终产物阳性反应的区域计数，可以对核酸进行量化。在常规定量PCR中，量化结果可能依赖于PCR过程的扩增效率。然而，dPCR不依赖于扩增循环的数目来测定初始样品量，消除量化靶核酸对不确定的指数式数据的依赖性并因此提供绝对量化。本专利技术的第一个方面涉及一种用于减小由光学假象引起的量化误差的方法。光学假象是自除预定来源以外的来源产生的光学信号。在本专利技术的背景中，它不是自dPCR测定法产生的，但是是光学过程中测定的光学信号的任何不想要的或非故意的改变。假象可以是自干扰事物诸如影响dPCR信号的杂质或光学信号测定中使用的技术或装置任一产生的。假象可以是任何种类的杂质，包括但不限于污垢，尘埃，刮痕，流体飞溅，例如分离硅油，毛发，纤维，来自指纹的污垢，反应区域的不正确填充或反应区域的分配结构的缺陷，例如由于某些原因而只有一半深度的分区。假象可以位于反应区域的下或上表面任一或其内部。污垢指使得产品不清楚或不纯的物质。污垢是使用者或观察员眼中不想要的物质(常常是小型颗粒或痕迹)。污垢的常见类型包括但不限于尘埃(有机或矿物质的一般粉末)，例如土壤，油，油脂等的残留物，污物(污秽物质，诸如粪便)，尘垢(黑色，根深蒂固的尘埃，诸如烟灰)和土壤(位于基岩顶部的粘土，沙子，和腐殖质的混合物)。光学假象也可以是由阵列表面的修饰引起的，诸如在表面(内侧或外侧)上去除或添加材料，包括但不限于刮痕，流体飞溅，例如分离硅油，毛发，纤维，来自指纹的污垢，或阵列结构的缺陷，例如由于某些原因而只有一半深度的分区。最后，反应区域的不正确填充(例如只有反应区域部分填充，仅仅)也可以引起假象。另外/或者，假象可以是由于成像期间的技术问题。这些假象是由于成像源和图像之间非故意的差异。该差异的原因可以是例如开花，色差，锯齿，失真，JPEG压缩，波纹或噪声。开花是能溢出到现有像素上，引起图像区域过度曝光的电荷泛滥。色差是色散所导致的效果，其中透镜未能将所有颜色聚焦至相同会聚点。它是因为透镜对于不同波长的光具有不同的折射率而发生的。透明材料的折射率随着波长的增加而减小，每个的度数是独特的。由于光谱中的每种颜色不能聚焦于单个共同点，因此色差自身表现为沿着将图像的暗和明部分分开的边界的颜色“边缘”。由于透镜的焦距f取决于折射率n，因此不同波长的光会聚焦在不同的位置上。锯齿或失真指数字图像中的对角线上可见的锯齿状边缘。像素是正方形的，而且因为对角线由一组正方形像素组成，所以当像素较大时它可以看上去像一系列阶梯。后期制作中的锐化会提高锯齿的可见度。JPEG压缩用于保存图像。JPEG是用于保存数字照片文件的最常见的照片文件格式。然而，JPEG给出图像质量和图像大小之间的平衡。当将文件保存为JPEG时，图像被压缩且质量丢失。当图像含有高频率的重复区域时引起波纹。这些细节可超出相机的分辨率。它看上去像图像上的波浪形彩色线。噪声在图像上显示为不想要的或杂散的色斑，而且噪声最常用地是由提高相机的ISO引起的。它在图像的阴影和黑色中会是最明显的，常常是红色，绿色，和蓝色的小点。噪声可以通过使用较低的ISO来降低。在第一个方面的方法的第一个步骤中，提供dPCR中使用的反应区域的阵列。dPCR中使用的反应区域可以是适合于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法，其中在反应区域的阵列中量化感兴趣核酸的量或浓度，该方法包括a)提供dPCR中使用的反应区域的阵列；b)测定每个反应区域中光学信号的分布；c)如果步骤b)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效；并d)自该感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。

【技术特征摘要】
2017.02.10 EP 17000209.11.一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法，其中在反应区域的阵列中量化感兴趣核酸的量或浓度，该方法包括a)提供dPCR中使用的反应区域的阵列；b)测定每个反应区域中光学信号的分布；c)如果步骤b)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效；并d)自该感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。2.一种用于确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法，该方法包括下述步骤：a)提供怀疑含有该感兴趣核酸的样品；b)在反应区域的阵列的每个反应区域中以该样品实施dPCR；c)测定每个反应区域中光学信号的分布；d)如果步骤c)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分布的话，将该反应区域鉴定为无效；并e)基于步骤d)中并未鉴定为无效的反应区域的dPCR结果计算该感兴趣核酸的量或浓度。3.权利要求1或2的方法，其中如果该反应区域中光学信号的分布特征在于(i)标准偏差超出阈，(ii)分布形态不适当，(iii)单个信号相对于信号均值的偏差超出阈和/或(iv)信号的均值显著偏离预期的话，将该反应区域鉴定为无效。4.权利要求1至3任一项的方法，其中该光学信号是通过使用光学标志物，优选光学可检测的填充控制标志物(fillcontrolmarker)或光学可检测的PCR探针测定的。5.权利要求1至4任一项的方法，其中该分布是通过每个反应区域的光栅成像测定的，特别是其中每个代表光学信号的光栅由光学装置，特别是相机的恒定数目的像素，尤其是一个像素组成和/或其中该分布特征在于该光学信号的均值，中值，标准偏差，最大和最低信号梯级和/或分布的形态。6.权利要求1至5任一项的方法，其中该光学信号是通过非荧光明或暗场或荧光检测方法测定的。7.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·瓦泽，F·贝特沙尔特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH