本发明专利技术涉及透明质酸生物工程技术领域，特别涉及一种小分子透明质酸干粉的高效生产方法：将高分子量透明质酸分批次分散溶解于水中，分批次添加透明质酸酶进行酶切反应，避免了高浓度底物抑制效应，实现了高浓度小分子透明质酸溶液的制备。同时，将高浓度小分子透明质酸溶液通过喷雾干燥的方式，得到小分子透明质酸干粉。本发明专利技术耗能低，无需有机溶剂，绿色无污染，过程染菌几率极低，便于运输和储藏，适合工业化大生产应用。
Preparation of a high concentration small molecule hyaluronic acid and efficient production of dry powder
The invention relates to the field of hyaluronic acid bioengineering technology, in particular to an efficient production method of small molecular hyaluronic acid dry powder: dissolving high molecular weight hyaluronic acid in water in batches, adding hyaluronidase in batches for enzyme digestion reaction, avoiding high concentration substrate inhibition effect, and realizing high concentration and small fraction. Preparation of sub hyaluronic acid solution. At the same time, the high concentration of small molecular hyaluronic acid solution through spray drying, small molecular hyaluronic acid dry powder. The invention has the advantages of low energy consumption, no need of organic solvents, green and pollution-free, extremely low bacterial contamination probability in the process, convenient transportation and storage, and is suitable for industrial production and application.
【技术实现步骤摘要】
一种高浓度小分子透明质酸的制备及其干粉的高效生产方法
本专利技术涉及透明质酸生物工程
，特别涉及一种小分子透明质酸干粉的高效生产方法。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid)简称HA，俗称玻尿酸，作为一种直链线性高分子黏性多糖，由β-1，3-N-乙酰葡糖胺和β-1，4-葡糖醛酸重复二糖单元组成。是人和动物组织细胞间质的主要成分，因其独特的分子结构和理化性质，使其具有强大的携带水分子能力、黏弹性和良好的生物相容性，已广泛应用于临床医学、化妆品、保健食品、整形美容等领域。透明质酸酶(Hyaluronidase，HAase)是广泛存在于自然界中的一类糖苷酶，通过特异性识别，作用于β-1，3糖苷键或β-1，4糖苷键来降解透明质酸。利用透明质酸酶可将高分子量透明质酸(Mr≥105)降解为小分子量透明质酸(Mr＝5KDa～20KDa)，甚至透明质酸寡聚糖(Mr≤10KDa)。根据文献研究表明，不同分子量大小的透明质酸分别具有不同的生物活性或生理学作用，高分子量透明质酸因其优良的携带水分子能力以及润滑功效，已广泛应用于化妆品行业及眼科、关节腔手术等领域。而小分子量透明质酸表现出非常高的生物活性，且极易透皮吸收，其在免疫调节、促进IL-8，TNF等炎症因子代谢，加速伤口愈合、新骨和新血管生成，甚至抑制肿瘤细胞扩散方面有非常良好的功效，同时具有优良的生物相容性，因此，小分子透明质酸在化妆品、保健食品、临床医药等领域的应用前景非常广阔。当前小分子透明质酸的制备有物理方法，化学法和生物酶解法。物理方法有干热高温降解、超声波降解、机械剪切降解及γ-射线辐照等。化学方法有酸碱水解、强氧化剂水解等。这些方法易导致透明质酸变色，效率较低，终产物分子量范围较大，且有工业废水及涉及射线辐射等各种不足。生物酶解法利用透明质酸酶来酶切高分子量透明质酸，裂解成小分子量透明质酸甚至透明质酸寡糖，反应条件温和，终产物分子量易控制，绿色无污染。专利CN103484513A公开了一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法，该专利利用水蛭来源透明质酸酶来降解透明质酸，得到寡聚透明质酸四糖、六糖、八糖、十糖。所述方法仅在实验室小批量进行，且酶添加量为100-13000U每毫克HA，酶的用量很大。同时，得到的小分子透明质酸和寡聚透明质酸终产物浓度较低，不易于工业化大规模生产。专利CN105670008A涉及到一种水溶性交联透明质酸干粉的制备方法，该专利的干燥方法是用有机溶剂反复沉淀、洗涤、抽滤、真空干燥得到交联透明质酸干粉。所述的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丙二醇或丙酮。此方法得到的干粉中仍残留有机溶剂，且涉及反复沉淀，有机溶剂的需求量巨大。同时，多次沉淀后的有机溶剂不能完全回收，易形成工业废液，造成污染。而且有机溶剂回收设备造价高昂。为解决现有技术生产小分子透明质酸浓度低，酶耗量大，有机溶剂残留的问题，本专利技术提供了一种高浓度小分子透明质酸的制备及其干粉的高效生产方法，是向反应体系中多次重复溶解高分子量透明质酸及多次添加一定酶活的透明质酸酶，反应一定时间得到高浓度小分子透明质酸溶液，再将高浓度小分子透明质酸溶液经过喷雾干燥，得到小分子透明质酸干粉。反应条件温和、耗酶量底、易操作、纯度高、产量高、无污染、经济高效，非常利于工业化大规模生产小分子透明质酸。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高浓度小分子透明质酸的制备及其干粉的高效生产方法，是通过以下步骤得到的：(1)向反应体系中溶解高分子量透明质酸，添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间。(2)向步骤(1)所得的酶解液中再溶解高分子量透明质酸，再添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间，完成高浓度小分子透明质酸的制备。(3)将步骤(2)所得的高浓度小分子透明质酸，通过过滤和喷雾干燥，得到小分子透明质酸干粉。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)中高分子量透明质酸的添加量为0.5-6kg(优选1-5kg，更优选3-4kg)，得到浓度为0.5％-6％(优选1％-5％，更优选3％-4％)的溶液。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(2)中高分子量透明质酸的添加量为0.5-6kg(优选1-5kg，更优选3-4kg)，得到浓度为1％-12％(优选2％-10％，更优选6％-8％)的溶液。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)和步骤(2)中分散溶解优选采用直径150mm，最大转速达1500转/分钟，锯齿状，可无级调速的分散盘。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)和步骤(2)中转速10-100转/分钟(优选45-50转/分钟)的搅拌桨，低速均匀搅拌反应。所述高分子量透明质酸的分子量为200KDa以上，优选200KDa-1200KDa。所述反应体系的PH为3.5-8.0之间(优选4.5-6.5之间)，温度为25-50℃(优选35.5-42℃)。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)中反应时间为0.5-3小时(优选1-2小时)。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(2)中反应时间为1-10小时(优选2-7小时)。所述透明质酸酶为动物来源透明质酸酶、重组人透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、细菌来源透明质酸裂解酶中的一种或一种以上。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)和步骤(2)中透明质酸酶的添加量为1x104IU-5x106IU每公斤透明质酸(优选1x105IU-5x106IU)。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(2)和步骤(3)中高浓度小分子透明质酸为浓度3％以上优选(6-8％)，分子量150KDa以下(优选1KDa-100KDa)，粘度1000mPa.s以下(优选500mPa.s以下)的透明质酸和透明质酸寡糖混合溶液。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(3)中过滤滤芯为PP熔喷滤芯、PP折叠滤芯、PTFE折叠滤芯中的一种(优选PP熔喷滤芯)，平均孔径是2-20um(优选5um)。所述的透明质酸为透明质酸金属盐或透明质酸衍生物。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(3)中喷雾干燥为离心式高转速喷雾干燥，最高转速可达30000转/分钟(优选28000转/分钟)或压力式喷雾干燥中的一种。所述喷雾干燥机的参数为：进风温度：210-300℃(优选240-290℃)出风温度：100-160℃(优选100-140℃)雾化盘转速：18000-30000转/分钟(优选28000转/分钟)进料泵转速：30-120转/分钟(优选30-90转/分钟)所述小分子透明质酸干粉的干燥失重为小于9％(优选1-9％)，得率为75-99％(优选80-97％)。在100L反应体系中，加入92L水，1500转/分钟分散溶解400KDa高分子量透明质酸4kg，控制PH5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入4x106IU酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400KDa高分子量透明质酸4kg，再向反应体系中加入3x106IU-6x106IU酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umPP熔喷滤芯过滤，得到8％高浓度小分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高浓度小分子透明质酸的制备及其干粉，其特征在于通过以下步骤得到的：(1)向反应体系中溶解高分子量透明质酸，添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间。(2)向步骤(1)所得的酶解液中再溶解高分子量透明质酸，再添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间，完成高浓度小分子透明质酸的制备。(3)将步骤(2)所得的高浓度小分子透明质酸，通过过滤和喷雾干燥，得到小分子透明质酸干粉。
【技术特征摘要】
1.一种高浓度小分子透明质酸的制备及其干粉，其特征在于通过以下步骤得到的：(1)向反应体系中溶解高分子量透明质酸，添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间。(2)向步骤(1)所得的酶解液中再溶解高分子量透明质酸，再添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间，完成高浓度小分子透明质酸的制备。(3)将步骤(2)所得的高浓度小分子透明质酸，通过过滤和喷雾干燥，得到小分子透明质酸干粉。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中高分子量透明质酸的添加量为0.5-6kg，分散溶解，得到浓度为0.5％-6％的溶液，步骤(2)中高分子量透明质酸的添加量为0.5-6kg，分散溶解，得到浓度为1％-12％的溶液。3.根据权利要求1-2任一所述方法，其特征在于所述的透明质酸为透明质酸金属盐或透明质酸衍生物，分子量为200KDa以上。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系的PH为3.5-8.0，温度为25-50℃。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中反应时间为0.5-3小时，步骤(2)中反应时间为1-10小时。6.根据权利要求1-5任一所述方法，其特征在于透明质...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭文平，魏晨，
申请(专利权)人：彭文平，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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