一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法技术

本发明专利技术属于食品检测技术领域，公开了一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法。将待测果蔬试样用甲酸‑乙腈超声提取，离心，取上清液干燥后加入甲酸水溶液混匀，然后用HLB固相萃取柱萃取，萃取物用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液复溶，得到待测液；用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液配制含有7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的混合标准溶液，采用UHPLC‑MS/MS检测得到标准曲线，同样条件下检测待测液，根据标准曲线计算待测液中7种典型真菌毒素的含量。本发明专利技术的方法适用于果蔬中4大类7种真菌毒素的同时测定，弥补了检测目标物单一的缺陷，具有检测限低、检测准确度高的优点。

A method for simultaneous detection of 7 typical mycotoxins in fruits and vegetables

The invention belongs to the technical field of food detection, and discloses a method for simultaneously detecting seven typical mycotoxins in fruits and vegetables. The fruit and vegetable samples were extracted by ultrasonic extraction with formic acid acetonitrile, centrifuged, dried supernatant and mixed with formic acid aqueous solution, then extracted by HLB solid phase extraction column, and the extract was dissolved in the mixture of ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile to get the solution to be tested. The mixed standard solution of mycotoxin AOH, AME, TeA, TEN, DON, PAT and OTA was determined by UHPLC / MS. Under the same conditions, the contents of seven typical mycotoxins were calculated according to the standard curve. The method of the invention is suitable for the simultaneous determination of 4 categories and 7 kinds of mycotoxins in fruits and vegetables, makes up the defect of single detection target, and has the advantages of low detection limit and high detection accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法
本专利技术属于食品检测
，具体涉及一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法。
技术介绍
水果和蔬菜含水量高、营养丰富，在生长、采收和储运等过程中，极易受到各种病原菌的侵染而发生腐烂，产生并积累各种真菌毒素。多数真菌毒素性质稳定，常规的贮运和加工条件难以将其彻底清除，就会对人类和动物的健康造成潜在威胁。研究显示，污染果蔬的真菌毒素主要包括交链孢毒素、赭曲霉毒素A(OTA)、展青霉素(PAT)和单端孢霉烯族毒素等。交链孢毒素是由交链孢霉产生的一系列代谢产物，交链孢霉是具有腐生和寄生作用的植物致病性菌，其中交链孢酚(AOH)、交链孢酚单甲醚(AME)、细交链格孢酮酸(TeA)和腾毒素(TEN)是果蔬中最常见的4种交链孢毒素。动物实验结果表明，AOH和AME对多个体系具有致突变性和遗传毒性作用。链孢毒素可使果实内部腐烂而表皮无明显变化，不能通过冲洗，分拣操作去除毒素，因此新鲜果蔬及其制品的交链孢毒素污染已成为重要的公共卫生问题。OTA具有较强的肝毒性和肾毒性，并有致畸、致癌和致突变作用。PAT具有神经毒性、遗传毒性、致畸和潜在的免疫毒性，大多数欧美国家规定PAT的限量为0-50μg/kg，我国规定苹果、山楂半成品的限量为100μg/kg。单端孢霉烯族毒素具有致畸、致癌和致突变作用，且耐热和耐酸，在加工中难以脱除；脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是其中污染最为广泛的一种，摄取含有DON的食物后会造成头疼、恶心、腹疼、贫血、免疫力下降；如果长期摄入，会造成致癌、致畸、遗传毒性、肝细胞毒性、中毒性肾损害、生殖紊乱、免疫抑制的发生。目前真菌毒素的检测方法主要有免疫学检测方法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法和毛细管电泳等。在前处理方面，常结合样品基质和目标真菌毒素的特性，采用常规固相萃取柱或免疫亲和柱富集、净化，或采用QuEChERS法净化，各有其优缺点。但是当前新鲜果蔬中真菌毒素的检测报道较少，已报道的果蔬中真菌毒素的检测研究多为单一目标物或同一种属的几个真菌毒素的检测。由于果蔬在储藏过程中会出现不同种属真菌毒素的污染，因此开展不同种属真菌毒素的高通量检测研究势在必行。
技术实现思路
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法。本专利技术采用HLB固相萃取和UHPLC-MS/MS检测方法，可以同时检测果蔬中7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA(其分子结构式图如附图1所示)。该检测方法前处理方法简单，可以简单、快速、准确的同时测定果蔬样品中的多种真菌毒素，回收率高、重现性好，能够满足痕量的分析要求。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法，包括如下步骤：(1)样品前处理将待测果蔬试样匀浆均质后用甲酸-乙腈混合溶剂超声提取，离心，取上清液干燥后加入甲酸水溶液混匀，得到试样溶液；将试样溶液用HLB固相萃取柱萃取，采用甲酸水溶液为淋洗液，甲醇为洗脱液，收集洗脱液干燥，固相残渣用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液复溶，过滤除去不溶物，得到待测液；(2)标准溶液的配制用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液配制含有7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的混合标准溶液，备用；(3)UHPLC-MS/MS(超高效液相色谱-二级质谱)检测将步骤(2)的混合标准溶液采用UHPLC-MS/MS检测得到标准曲线，同样条件下检测步骤(1)的待测液，根据标准曲线计算待测液中7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的含量。优选地，步骤(1)中所述甲酸-乙腈混合溶剂中甲酸的体积百分含量为1％。优选地，步骤(1)中所述超声的时间为0～30min，更优选超声的时间为20min。优选地，步骤(1)中所述甲酸水溶液中甲酸的体积百分含量为1％。优选地，步骤(1)中所述乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液中乙酸铵水溶液的浓度为10mmol/L，乙酸铵水溶液和乙腈的体积比为8:2。优选地，步骤(3)中所述UHPLC检测的色谱柱为BEHC18色谱柱，流动相为乙腈和乙酸铵水溶液的混合洗脱剂；更优选UPLC检测条件如下：色谱柱：BEHC18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：A：10mmol/L乙酸铵水溶液，B：乙腈；梯度洗脱程序：0.0～2.0min，15％B(vt.％)；2.0～6.0min，15％～60％B；6.0～7.0min，60％～90％B；7.0～8.0min，90％B；8.0～8.5min，90％～15％B；8.5～11.0min，15％B；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃。优选地，步骤(3)中所述MS检测条件如下：电喷雾电离(ESI)正、负模式，检测模式：动态多反应监测(MRM)模式；ESI-模式下：气帘气(Curtaingas)：40Psi；碰撞气(Collisiongas)：8Psi；喷雾电压(ionSprayVoltage)：-3800V；雾化温度(Temperature)：550℃；雾化气(IonSourceGas1)：40Psi；辅助气(IonSourceGas2)：60Psi；ESI+模式下：气帘气(Curtaingas)：40Psi；碰撞气(Collisiongas)：8Psi；喷雾电压(ionSprayVoltage)：4000V；雾化温度(Temperature)：550℃；雾化气(IonSourceGas1)：40Psi；辅助气(IonSourceGas2)：60Psi。相对于现有技术，本专利技术的检测方法具有如下优点及有益效果：(1)样品前处理是真菌毒素分析过程中的关键环节，直接影响后续超高效液相色谱-串联质谱的分析结果，本专利技术真菌毒素的提取方法，可快速、高效提取样品中的真菌毒素，方法简单可靠，提取得到的样品能够满足分析要求。(2)本专利技术方法设计合理，通过标准品的调谐实验，得到了最优化的真菌毒素的色谱质谱测定参数，如流动相、色谱、质谱条件等；本专利技术的方法适用于果蔬中4大类7种真菌毒素的同时测定，弥补了检测目标物单一的缺陷，本方法检测限低、检测准确度高、对于果蔬中真菌毒素的方法定量限可达到0.2～10.0μg/kg。(3)由于二级质谱通过同时扫描待测无机阴离子的母离子分子离子峰和子离子分子离子峰的方式，达到针对待测无机阴离子准确定性的效果，而且能够有效排除假阳性。附图说明图1为7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的分子结构式图。图2为采用实施例2优化后的色谱条件下，7种典型真菌毒素的提取离子色谱图。图3为实施例3中采用1％甲酸-乙腈(FA-AC)、0.1mol/LHCl-乙腈(HCl-ACN)、1％甲酸-乙酸乙酯(FA-EAC)、0.1mol/LHCl-乙酸乙酯(HCl-EAC)4种提取溶剂对阴性生菜样品进行加标实验的回收率结果对比图。图4为实施例4中采用三种不同吸附材料(PSA、C18、GCB)在不同用量下QuEChERS净化实验结果图。图5为实施例4中采用不同固相萃取柱和不同淋洗液条件下的固相萃取净化实验结果图。图6为实施例6中草莓在不同温度条件(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)样品前处理将待测果蔬试样匀浆均质后用甲酸‑乙腈混合溶剂超声提取，离心，取上清液干燥后加入甲酸水溶液混匀，得到试样溶液；将试样溶液用HLB固相萃取柱萃取，采用甲酸水溶液为淋洗液，甲醇为洗脱液，收集洗脱液干燥，固相残渣用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液复溶，过滤除去不溶物，得到待测液；(2)标准溶液的配制用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液配制含有7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的混合标准溶液，备用；(3)UHPLC‑MS/MS检测将步骤(2)的混合标准溶液采用UHPLC‑MS/MS检测得到标准曲线，同样条件下检测步骤(1)的待测液，根据标准曲线计算待测液中7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的含量。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)样品前处理将待测果蔬试样匀浆均质后用甲酸-乙腈混合溶剂超声提取，离心，取上清液干燥后加入甲酸水溶液混匀，得到试样溶液；将试样溶液用HLB固相萃取柱萃取，采用甲酸水溶液为淋洗液，甲醇为洗脱液，收集洗脱液干燥，固相残渣用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液复溶，过滤除去不溶物，得到待测液；(2)标准溶液的配制用乙酸铵水溶液和乙腈的混合溶液配制含有7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的混合标准溶液，备用；(3)UHPLC-MS/MS检测将步骤(2)的混合标准溶液采用UHPLC-MS/MS检测得到标准曲线，同样条件下检测步骤(1)的待测液，根据标准曲线计算待测液中7种典型真菌毒素AOH、AME、TeA、TEN、DON、PAT和OTA的含量。2.根据权利要求1所述的一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述甲酸-乙腈混合溶剂中甲酸的体积百分含量为1％。3.根据权利要求1所述的一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述超声的时间为0～30min。4.根据权利要求1所述的一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述甲酸水溶液中甲酸的体积百分含量为1％。5.根据权利要求1所述的一种同时检测果蔬中7种典型真菌毒素的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖凯军，董浩，王震，朱良，王兆梅，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44