一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法技术

一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR‑gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。

A method of HMGCR gene knockout based on CRISPR/Cas9 Technology

A method of HMGCR gene knockout based on CRISPR/Cas9 technology is to design two CRISPR/Cas9 target sequences for HMGCR gene, synthesize single strands of gRNA in vitro, and annealed to obtain two target insertion fragments of gRNA double stranded DNA, and insert them into PX459 (pSpCas9(BB)2A_Puro) V2.0 vector respectively to obtain the target HMGCR gene. Two plasmids with different loci were transfected into PK15 cells and purinomycin was used to treat the cells. The genomic DNA of the treated cells was extracted and amplified by PCR. The PCR products were denatured and annealed, then HMGCR gene was knocked out by T7E1. This method can be used to analyze the HMGCR gene knockout sequence and mRNA expression, and can be used to verify the miss-target phenomena by PCR combined with T7E1 enzyme treatment, so as to determine the specificity of HMGCR_gRNA based on the target sequence. This method can be used not only in cell and animal models to knock out HMGCR gene, but also in other gene knockout. It has the advantages of good effect, simplicity, economy and short time.

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas系统(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats-associatedproteinsystems)是细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的获得性免疫机制。由于该系统具有诸多优势已被广泛应用于基因编辑技术，其强大、高效的基因组编辑功能已被成功应用于多种生物遗传基因改造，包括细菌、植物、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠、猪、甚至高等非人灵长类动物。大部分研究都显示，与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)第一、二代基因编辑技术相比较，CRISPR/Cas系统能更好地识别靶基因，并且CRISPR/Cas9系统结构组成简单，相应地其构建仅需设计、合成一对引物。因此该基因编辑技术具有更高的编辑效率、更简单的操作、更低的成本、更宽广的编辑范围等优势。CRISPR/Cas9技术是生命科学领域研究技术手段的一个革命性突破，从细菌、植物到哺乳动物诸多物种中都成功实现了应用。在功能基因筛选、转录调控研究、构建遗传基因修饰、抗病毒研究、癌症研究、遗传性疾病研究、单分子标记研究和基因治疗等研究和开发领域中具有广泛的应用。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase,HMGCR)，又称羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，是肝脏通过甲醛戊酸途径合成内源性胆固醇过程中的关键酶或限速酶，在心脑血管/代谢性疾病的发生发展中具有重要功能，也是目前临床常用的他汀类调脂药的主要作用靶点。而近年研究显示，该基因/蛋白还在多种病毒的感染过程中发挥重要作用。然而迄今为止，尚未见有关利用CRISPR/Cas9系统特异性地将HMGCR基因实现敲除的报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，该方法能高效、快速、方便地实现在细胞、动物体内敲除HMGCR基因，从而可应用于该基因功能与机制研究，以及相关通路的研究和药物开发。为达上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，该方法步骤如下：1)针对SEQIDNO:1所示的HMGCR基因片段设计如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的CRISPR/Cas9靶标序列，接着合成如SEQIDNO:4、5和SEQIDNO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒PX459-HMGCR-gRNA1和PX459-HMGCR-gRNA2；2)将上述两质粒分别转染至PK15细胞中，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素处理细胞3天进行药筛；提取嘌呤霉素药筛后的细胞基因组DNA，以该提取的DNA为模板，用SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示的HMGCR基因特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物变性、退火后利用T7E1酶酶切进行HMGCR基因敲除鉴定。鉴定结果表明，构建的质粒PX459-HMGCR-gRNA中含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示HMGCR基因靶标序列的gRNA，该gRNA能与trRNA构成特异的识别结构，从而引导Cas9酶特异的剪切HMGCR基因对应序列。上述质粒PX459-HMGCR-gRNA1和PX459-HMGCR-gRNA2是以PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0质粒为起始载体，先用Bbs1酶切并回收骨架，再合成如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7所示的两对带有接头的核苷酸序列，合成后稀释并退火作为插入片段；然后用T4DNA连接酶在16℃连接过夜将骨架和插入片段连接，连接产物转化，挑克隆测序鉴定获得。上述步骤2)中提及的PCR反应体系包括2xPCRMix12.5μl、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示引物各1μl、模板DNA2μl及ddH2O8.5μl。上述步骤2)中提及的PCR产物变性、退火条件为95℃5min；94℃2s，-0.1℃/cycle,200times；75℃1s，-0.1℃/cycle,600times；16℃2min。根据本专利技术所述的HMGCR基因敲除方法，将PX459-HMGCR-gRNA1、和PX459-HMGCR-gRNA2转染至PK15细胞，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素(Puromycin)处理细胞3天，然后收集剩余细胞，一部分细胞用于提取基因组DNA进行所设计gRNAs效率分析；另一部分细胞进行低密度重新铺板，以便获得单细胞克隆。提取单克隆敲除细胞株基因组DNA，PCR扩增HMGCR基因特异片段并将PCR产物变性，再用退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定基于HMGCR-gRNAs的CRISPR/Cas9剪切效率及单细胞克隆中HMGCR基因敲除鉴定分析，利用TA克隆技术和荧光定量PCR方法分别分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况并验证敲除细胞株有无脱靶。其中，检测基因敲除后表达水平的HMGCR实时PCR引物如SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示，内参对照GAPDH引物如SEQIDNO:12和SEQIDNO:13所示；检测是否存在脱靶现象，是利用如SEQIDNO:14和SEQIDNO:15；SEQIDNO:16和SEQIDNO:17；SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示引物分别进行PCR扩增，再利用T7E1酶处理，接着电泳分析DNA条带，从而获知所利用的HMGCR-gRNA会否在基因组其它位点造成非特异性切割。本专利技术同时提供所述的HMGCR基因敲除方法所获得的HMGCR基因敲除PK15细胞株。本专利技术的基于CRISPR/Cas9技术的HMGCR基因敲除方法具有以下特点和优点：利用CRISPR/Cas9系统，设计了一段gRNA来特异识别HMGCR基因，最终导致其功能失活。本方法可用于HMGCR基因的定向敲除，具有高效、快速、简单经济等特点，对于HMGCR基因敲除动物模型及相关通路的研究具有重要意义。附图说明图1是gRNA与Cas9酶结合特异识别并剪切HMGCR基因示意图。图2是PX459‐HMGCR‐gRNAs质粒构建示意图。图3是利用PCR结合T7E1酶切分析两个PX459‐HMGCR‐gRNAs剪切效率。其中，1：PK15，2：PX459‐puro‐HMGCR‐gRNA1，3、4：PX459‐puro‐HMGCR‐gRNA2分别表示基因组DNA来源于未转染或转染相应gRNA质粒的细胞。图4是利用PCR结合T7E1酶切鉴定所示单克本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，该方法步骤如下：1)针对SEQ ID NO:1所示的HMGCR基因片段设计如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的CRISPR/Cas9靶标序列，接着合成如SEQ ID NO:4、5和SEQ ID NO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒PX459‑HMGCR‑gRNA1和PX459‑HMGCR‑gRNA2；2)将上述两质粒分别转染至PK15细胞中，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素处理细胞3天进行药筛；提取嘌呤霉素药筛后的细胞基因组DNA，以该提取的DNA为模板，用如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的HMGCR基因特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物变性、退火后利用T7E1酶进行酶切鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，该方法步骤如下：1)针对SEQIDNO:1所示的HMGCR基因片段设计如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的CRISPR/Cas9靶标序列，接着合成如SEQIDNO:4、5和SEQIDNO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒PX459-HMGCR-gRNA1和PX459-HMGCR-gRNA2；2)将上述两质粒分别转染至PK15细胞中，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素处理细胞3天进行药筛；提取嘌呤霉素药筛后的细胞基因组DNA，以该提取的DNA为模板，用如SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示的HMGCR基因特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物变性、退火后利用T7E1酶进行酶切鉴定。2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，所述质粒PX459-HMGCR-gRNA1和PX459-HMGCR-gRNA2是以PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0质粒为起始载体，先用Bbs1酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱兵，刘谭彬，郭时印，谭磊，雷新诺，王乃东，胡意，李亚兰，杨凌宸，杨毅，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43