一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用，属于水产动物分子生物学领域。本发明专利技术的技术方案要点为：以淇河鲫cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，PCR产物CaGal与载体pET‑32a连接，构建pET‑32a‑CaGal重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET‑32a‑CaGal‑BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白。本发明专利技术制备的CaGal重组蛋白可保持其天然生物学活性，能够有效抑制嗜水气单胞菌等病原菌，抑菌效果明显，并且制备方法简单，可作为一种新型的鱼类免疫添加剂或抗菌药物。

Preparation method of fish derived galectin CaGal recombinant protein and its application

The invention discloses a preparation method of fish-derived galactose lectin CaGal recombinant protein and its application, belonging to the field of aquatic animal molecular biology. The key points of the technical scheme of the invention are as follows: taking the Qihe crucian carp cDNA as the template, using F/R as the primer for PCR amplification, the PCR product CaGal is linked with the carrier pET 32A to construct the recombinant expression vector pET 32a CaGal; transforming into E. coli BL21 (DE3) to obtain the E. coli expression strain pET 32a CaGal BL21, which can express galactose agglutination. The recombinant protein of CaGal was obtained by isolation and purification of CaGal recombinant protein. The CaGal recombinant protein prepared by the invention can maintain its natural biological activity, effectively inhibit pathogenic bacteria such as Aeromonas hydrophila, has obvious bacteriostatic effect and simple preparation method, and can be used as a new type of fish immune additive or antibiotic.

【技术实现步骤摘要】
一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用
本专利技术属于水产动物分子生物学
，具体涉及一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
淇河鲫（Qihecruciancarp，Carassiusauratus），又称“双背鲫”，为天然三倍体鱼类，产于豫北淇河，生长迅速、肉味鲜美且营养价值高，为“淇河三珍”之首，是河南省特有的优质水产品种之一。近年来，伴随淇河鲫养殖范围扩大，养殖密度增加，鱼类免疫力下降，导致病害逐渐增多。其中危害较大的是嗜水气单胞菌引起的淡水鱼类细菌性出血病。该病传播迅速、死亡率极高，严重影响了淇河鲫养殖业的经济与生态效益。因此，深入了解淇河鲫先天免疫，系统研究其感染嗜水气单胞菌后的免疫应答机制，有助于通过多途径联合运用最大限度地提高鱼类免疫力，促进淇河鲫养殖业的可持续发展。半乳糖凝集素（galectin）是进化上较为保守的凝集素家族成员。具有以下典型特征：具有保守的糖识别结构域（CRD），能够特异性结合β-半乳糖苷，没有信号肽，活性发挥不依赖Ca2+，广泛分布于动物、植物及微生物。半乳糖结合凝集素是一类多功能分子，参与RNA转录后加工、肿瘤转化、细胞凋亡、细胞间粘附及细胞生长调节等；并且半乳糖凝集素还作为模式识别受体识别细菌、病毒、真菌及寄生虫的表面糖基，启动先天免疫，在机体的天然免疫防御中发挥重要作用。但是，目前从鱼类中鉴定到的半乳糖凝集素较少。本专利技术所述半乳糖凝集素CaGal为淇河鲫首例报道的半乳糖凝集素，并且发现该凝集素具有效果明显的抑菌作用。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法及其应用，该方法制得的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白可保持其天然生物学活性，能够有效抑制嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）等病原菌且抑菌效果明显。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：以淇河鲫肝脏cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，其中正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为KpnI酶切位点，反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为HindIII酶切位点，PCR产物CaGal与载体pET-32a连接构建pET-32a-CaGal重组表达载体；将pET-32a-CaGal重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，该鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步优选，所述pET-32a-CaGal重组表达载体的具体构建过程为：（1）CaGal基因的PCR扩增提取淇河鲫肝脏总RNA，以OligdT为引物进行cDNA的合成，根据获得CaGal的cDNA序列，设计引物如下：正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为KpnI酶切位点；反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为HindIII酶切位点；以淇河鲫肝脏cDNA为模板，引物F/R扩增获得963bp的CaGal序列，反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，63℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃终延伸10min；（2）将得到的PCR产物CaGal与原核表达载体pET-32a分别进行KpnI和HindIII双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接；（3）连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，37℃180rpm振荡培养过夜，提取质粒，KpnI和HindIII双酶切鉴定及测序结果表明，CaGal基因正确插入到载体pET-32a相应酶切位点，pET-32a-CaGal重组表达载体构建成功。进一步优选，所述大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21的具体制备过程为：（1）将鉴定正确的重组表达载体pET-32a-CaGal5μL加入到预冷的25μLBL21(DE3)感受态细胞中，冰上预冷30min，42℃水浴热激90s，然后冰上放置3min，加入200μL无氨苄青霉素的LB液体培养基复活培养，培养条件为37℃，180rpm，60min；100μL的菌液涂布在含有100µg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h；（2）挑取单菌落接种到含有100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，酶切鉴定，筛选出阳性转化子，获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21。进一步优选，所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的具体制备过程为：（1）大肠杆菌表达菌株的培养与诱导表达将筛选得到的阳性转化子pET-32a-CaGal-BL21接种于含有100µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，按1:100接种于新的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌至OD600＝0.6，然后加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，37℃，220rpm诱导表达6h，6000rpm，15min收集菌体，20mLPBS重悬后，在冰浴中超声破碎，超声3s、间歇3s，全程55min，破碎后的菌液4℃，10000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，CaGal重组蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中；（2）包涵体变性及复性20mLBufferA将沉淀重悬，BufferA：50mMTris-HCl、5mMEDTA、pH7.9，4℃10000rpm离心25min，弃上清，保留沉淀；20mLBufferB重悬沉淀，BufferB：50mMTris-HCl、5mMEDTA、2M脲、pH7.9，离心后将上清保留以备检测，并重复该步骤一次；沉淀用20mLBufferC重悬，BufferC：8M脲、0.1MTris-HCl、10mMDTT、pH7.9，置于37℃恒温摇床上220rpm震荡1-2h，4℃、10000rpm离心10min后留上清；将上清置入透析袋，放入1L透析液中，透析液：0.1MTris-HCl、5mML-Cysteins、pH7.9，4℃透析15h以上，并重复一次，透析结束后，蛋白复性液4℃、10000rpm离心15min，留上清；（3）重组蛋白的亲和纯化Ni-IDA柱准备：将Ni-IDA琼脂糖振荡均匀，取2mL加入空柱，静置3min，待Ni-IDA琼脂糖沉降均匀；Ni-IDA柱的预处理：3倍柱体积的结合缓冲液冲洗，缓冲液：20mMTris-HCl、5mM咪唑、0.5MNaCl、pH7.9；将透析后的重组蛋白，逐滴加入柱中，每次加1mL，待蛋白液流出后再加入1mL，直至所有样品加完，加入10倍柱体积的结合缓冲液洗脱未结合在柱上的蛋白；用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液各5mL分别收集洗脱液；通过SDS-PAGE检测洗脱液的蛋白纯度以及浓度，获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白。本专利技术所述的鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白作为鱼类免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：以淇河鲫肝脏cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，其中正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为Kpn I酶切位点，反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为Hind III酶切位点，PCR产物CaGal与载体pET‑32a连接构建pET‑32a‑CaGal重组表达载体；将pET‑32a‑CaGal重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET‑32a‑CaGal‑BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，该鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：以淇河鲫肝脏cDNA为模板，采用F/R为引物进行PCR扩增，其中正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为KpnI酶切位点，反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为HindIII酶切位点，PCR产物CaGal与载体pET-32a连接构建pET-32a-CaGal重组表达载体；将pET-32a-CaGal重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21，即可表达半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，经分离和纯化获得鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白，该鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：pET-32a-CaGal重组表达载体的具体构建过程为：（1）CaGal基因的PCR扩增提取淇河鲫肝脏总RNA，以OligdT为引物进行cDNA的合成，根据获得CaGal的cDNA序列，设计引物如下：正向引物F：CGGGGTACCATGGCTTTTTATCAGCAACAGCCGT，划线部分为KpnI酶切位点；反向引物R：CCCAAGCTTTTAAGCCTGCACAAAAGTCAGCTGC，划线部分为HindIII酶切位点；以淇河鲫肝脏cDNA为模板，引物F/R扩增获得963bp的CaGal序列，反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，63℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃终延伸10min；（2）将得到的PCR产物CaGal与原核表达载体pET-32a分别进行KpnI和HindIII双酶切，酶切产物回收后于16℃过夜连接；（3）连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，37℃180rpm振荡培养过夜，提取质粒，KpnI和HindIII双酶切鉴定及测序结果表明，CaGal基因正确插入到载体pET-32a相应酶切位点，pET-32a-CaGal重组表达载体构建成功。3.根据权利要求1所述鱼源半乳糖凝集素CaGal重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌表达菌株pET-32a-CaGal-BL21的具体制备过程为：（1）将鉴定正确的重组表达载体pET-32a-CaGal5μL加入到预冷的25μLBL21(DE3)感受态细胞中，冰上预冷30min，42℃水浴热激90s，然后冰上放置3min，加入200μL无氨苄青霉素的LB液体培养基复活培养，培养条件为37℃，180rpm，60min；100μL的菌液涂布在含有100µg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h；（2）挑取单菌落接种到含有100µg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔祥会，王莉，张杰，赵贤亮，裴超，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41