一种检测血清4型禽腺病毒的双单抗夹心ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种血清4型禽腺病毒双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒，其中包括：包被抗FAdV‑4纤突蛋白蛋白单克隆抗体（捕获抗原的抗体）的酶标板、酶标记抗FAdV‑4纤突蛋白单克隆抗体（检测抗体）。捕获抗体和检测抗体分别针对FAdV‑4纤突蛋白2种不同的抗原决定簇：包被在酶标板的抗FAdV‑4纤突蛋白单克隆抗体和酶标记抗FAdV‑4纤突蛋白单克隆抗体。本发明专利技术试剂盒操作简便、快速，能特异性检测出4型禽腺病毒，而与流感病毒（AIV）、马立克病毒（MDV）、血清8型禽腺病毒（FAdV‑8）、禽网状内皮组织增生症病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）以及SPF鸡肝组织研磨液等均不反应。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

A double monoclonal antibody ELISA kit for detection of avian adenovirus type 4 in sera

The invention provides a sandwich ELISA antigen detection kit for serum type 4 avian adenovirus double monoclonal antibodies, which comprises an enzyme labeled plate coated with a monoclonal antibody against FAdV_4 plasminoprotein (capture antigen antibody) and an enzyme labeled monoclonal antibody against FAdV_4 plasminoprotein (detection antibody). The captured antibody and the detected antibody were directed against two different antigenic determinants of FAdV_4 plasmin: the monoclonal antibody against FAdV_4 plasmin coated on the enzyme plate and the enzyme-labelled monoclonal antibody against FAdV_4 plasmin. The kit has the advantages of simple and rapid operation, and can specifically detect type 4 avian adenovirus, and is associated with influenza virus (AIV), Marek virus (MDV), serum type 8 avian adenovirus (FAdV_8), Avian Reticuloendotheliosis Virus (REV), avian leukemia virus (ALV), infectious bursal disease virus (IBDV) and SPF. Chicken liver tissue lapping solution did not respond. The method has the advantages of low cost, remarkable economic benefit and wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种检测血清4型禽腺病毒的双单抗夹心ELISA试剂盒
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测血清4型禽腺病毒的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。
技术介绍
禽腺病毒是腺病毒科、禽腺病毒属的成员。迄今为止，通过交叉中和试验鉴定分为5个亚群(FAdV-AtoFAdV-E)和12个血清型(FAdV-1to8aand8bto11)。FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。历史记录及各地病毒分离鉴定发现，目前高致病性FAdV-4在国内鸡群流行较广泛，然目前尚无针对FAdV-4快速检测方法及其试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种检测血清4型禽腺病毒的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。本专利技术的原理和最核心的关键技术是利用两个抗FAdV-4纤突蛋白2的特异性单克隆抗体建立了检测FAdV-4的双单抗夹心ELISA方法。实现本专利技术目的的技术方案是：一种检测血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,包括:(1)包被抗FAdV-4蛋白单克隆抗体(捕获抗原的抗体)的酶标板；(2)酶标记FAdV-4蛋白单克隆抗体(检测抗体)；其中，包被在酶标板的FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体与酶标记FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体分别针对FAdV-4纤突蛋白2种不同的抗原决定簇。本专利技术以分泌抗体效价高的2株针对FAdV-4纤突蛋白2种不同表位抗原决定簇的杂交瘤细胞株进行实验。在本专利技术实施例中，包被在酶标板的抗FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株4A3分泌获得，酶标记抗单克隆抗体为杂交瘤细胞株3C2分泌获得。本专利技术所述酶标记抗FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体的标记酶是辣根过氧化物酶，使用酶标试剂盒进行标记(厂家：Thermo，批号：31489)，并进行了一些细节上的改进，这有效地保证了本方法的高敏感性。具体方法如下：(1)将1mg冻干的辣根过氧化物酶溶于100μL双蒸水中。(2)加入1mg纯化后的单克隆抗体，混匀。(3)在通风橱中加入10μL硼氢化氰钠，混匀，室温静置1h。(4)加入20μL淬灭液终止连接，室温静置15min即得此酶标记抗体。4℃保存。单克隆抗体可按照如下方法包被到酶标板:将2.66μg/mL的单克隆抗体按100μL/孔加入到酶标板中，4℃放置12-16h，用PBST洗涤后，用5％脱脂乳封闭，350μL/孔，于37℃放置2h，再用PBST洗涤。此外，本专利技术试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种:稀释液、酶标抗体、10×洗涤液、阳性对照、阴性对照、TMB显色液、终止液。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术运用本实验已经制备出的分别识别FAdV-4纤突蛋白上2个不同线性表位的2株单克隆抗体。2株单克隆抗体分别针对FAdV-4纤突蛋白2不同线性表位的2株单克隆抗体对抗原进行捕获和检测，相对于仅用一株单克隆抗体建立的抗体夹心ELISA方法来说，敏感性大大提高，更适用于临床样本中微量抗原的检测。与目前常用于FAdV-4检测中和以及琼扩试验等方法相比，本专利技术建立的双抗体夹心ELISA抗原检测法成本低、操作简便、重复性好，适用于基层临床推广应用。本试剂盒的建立为FAdV-4流行病学研究及疫病防控、净化提供了实用、快速、有效的检测工具。附图说明图1纯化后3C2和4A3单抗的SDS-PAGE鉴定。(泳道1为纯化后3C2，泳道2为纯化后4A3)具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例1(1)单克隆抗体的制备及特性鉴定包被在酶标板的抗FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株4A3分泌获得，酶标记抗单克隆抗体为杂交瘤细胞株3C2分泌获得。杂交瘤细胞株的具体制备方法及特性鉴定记载于《中国家禽》2017年第19期文章中，文章名称为：抗血清4型禽腺病毒纤突蛋白2的单克隆抗体研制及其部分特性研究。制备3C2和4A3的单克隆抗体腹水。利用GE公司的ProteinG预装柱进行单克隆抗体IgG纯化。纯化后利用SDS-PAGE鉴定，结果显示获得了纯度很好的单克隆抗体，如图1所示。(2)酶标单克隆抗体的制备使用酶标试剂盒对杂交瘤细胞3C2分泌的单克隆抗体进行HRP酶标记标记。3C2这株单克隆抗体经过酶标记后，记为3C2-HRP。(3)单克隆抗体包被浓度及酶标单克隆抗体工作浓度的确定用方阵滴定法来测定捕捉抗体及检测抗体最佳使用浓度，最终确定单克隆抗体包被浓度为2.66μg/mL，每孔100ul；酶标抗体的作用浓度为0.33μg/mL。(4)双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的构建和检测过程1.包被酶标板:将杂交瘤细胞4A3分泌的单克隆抗体的IgG提取并纯化后，用包被液稀释为2.66μg/mL,100μL/孔，4℃放置12-16h；2.封闭:取出包被酶标板，用PBST洗涤1次；用5％脱脂乳封闭，350μL/孔，37℃放置2h，再用PBST洗涤；3.加样:取样品加入上述封闭好的酶标板，100μL/孔,阴阳性对照1:50稀释，37℃反应60min，用PBST洗涤5次；不同检测样品的前处理:鸡肝：取1g鸡肝组织，加入1mlPBS进行研磨，4℃12000rpm离心5min，取上清，用PBST进行稀释；分离病毒的鸡肝细胞上清:不用处理，直接取样；4.加酶标单抗:将3C2-HRP稀释到0.33μg/ml，100μL/孔，37℃反应60min，PBST洗涤5次；5.显色:加入TMB显色液，100μL/孔，37℃反应15min；6.终止:显色后，每孔加入50μL2mo1/mLH2S04终止；7.读板:酶标仪上测定各孔OD450nm，进行结果判定。OD450nm大于0.2判为阳性，小于0.2判为阴性。(5)双抗体夹心ELISA特异性反应分别在相同条件下，对流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)、血清8型禽腺病毒(FAdV-8)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)以及传染性法氏囊病毒(IBDV)进行检测。结果表明，该ELISA只与FAdV-4病毒反应，而与所检测的其它病毒均没有反应。说明该方法具有很好的特异性(见表1双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的特异性)。(6)双单体夹心ELISA抗原检测试剂盒敏感度检测将FAdV-4病毒以及GST-FAdV-4-F2原核表达蛋白进行倍比稀释，对本专利技术ELISA抗原检测试剂盒的灵敏度进行检测。检测结果发现，该ELISA试剂盒可检测的最低量FAdV-4病毒量约为104个TCID50/ml(表2双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒敏感度检测)，可检测的最低量GST-FAdV-4-F2原核表达蛋白约28ng/ml(表2)。(7)双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒临床检测效果对临床上采集的感染FAdV-4的鸡的鸡肝组织研磨液及SPF鸡肝组织研磨液进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血清4型禽腺病毒的双抗体夹心 ELISA 抗原检测试剂盒，其特征在于，包括:
1)包被抗FAdV‑4纤突蛋白单克隆抗体的酶标板；2)酶标记抗FAdV‑4纤突蛋白单克隆抗体；
其中，包被在酶标板的抗FadV‑4纤突蛋白单克隆抗体与酶标记抗FAdV‑4纤突蛋白单克隆抗体分别针对FAdV‑4纤突蛋白2不同的抗原决定簇；包被在酶标板的抗FadV‑4型禽腺病毒纤突蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株4A3分泌获得，酶标记抗抗4型禽腺病毒纤突蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株3C2分泌获得。

【技术特征摘要】
1.一种检测血清4型禽腺病毒的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，包括:
1)包被抗FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体的酶标板；2)酶标记抗FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体；
其中，包被在酶标板的抗FadV-4纤突蛋白单克隆抗体与酶标记抗FAdV-4纤突蛋白单克隆抗体分别针对FAdV-4纤突蛋白2不同的抗原决定簇；包被在酶标板的抗FadV-4型禽腺病毒纤突蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株4A3分泌获得，酶标记抗抗4型禽腺病毒纤突蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株3C2分泌获得。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记蛋白单...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，王萍，邵红霞，秦爱建，田晓彦，王伟康，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32