荧光型细菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光型细菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法，属于生物化学技术领域。该细菌检测膜包括基材层及设置在基材层上的检测层，基材层为由纳米纤维膜组成，检测层为由功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物组成，功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物通过层层自组装的方式均匀交替组装设置在纳米纤维膜表面。本发明专利技术的细菌检测膜可在5分钟内快速的实现对浓度为10～105CFU/ml的细菌检测，检测方法简单，在环境、食品和临床医学领域都具备较好的应用。

Fluorescent bacteria detection film, preparation method and bacterial detection method thereof

The invention discloses a fluorescent bacterial detection membrane, a preparation method and a bacterial detection method, belonging to the biochemical technical field. The bacterial detection membrane consists of a substrate layer and a detection layer arranged on the substrate layer. The substrate layer is composed of a nanofiber membrane. The detection layer is composed of functional cationic polymers and anionic polymers. The functional cationic polymers and anionic polymers are evenly assembled on the nanofibers by layer-by-layer self-assembly. The surface of the membrane. The bacterial detection membrane of the invention can quickly detect bacteria with the concentration of 10-105 CFU/ml in 5 minutes. The detection method is simple and has good application in the fields of environment, food and clinical medicine.

【技术实现步骤摘要】
荧光型细菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法
本专利技术涉及细菌检测膜，属于生物化学
，具体地涉及一种荧光型细菌检测膜和制备方法及其细菌检测的方法。
技术介绍
对常见细菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等进行高效、快速的检测是医疗卫生、食品安全、环境等各领域较为关注的问题之一。目前常用的检测方法通常需要借助于实验仪器，该种测定方法具备高度的选择性、专一性和准确性等的优点，缺点是检测周期长，如常见检测周期长达0.5天～7天，且检测过程繁琐、工作量大，此外，由于该种测定方法的技术要求高，通常需要专业人员实际操作，无法满足细菌实时检测的需要。因此，亟需发展能够快速、准确简便的检测细菌浓度的新型材料。细菌的膜化检测是解决目前检测方法局限的有利方法，如中国专利技术专利申请(申请公开号：CN101676723A，申请公开日：2010-03-24)公开了一种用于检测检测鼠疫细菌感染的免疫层析膜及其制备方法。该免疫层析膜为将鼠疫耶尔森氏菌多糖抗原以及可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合的抗体固化在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线，优点是特异性强、简便、快捷，缺点是抗原的使用增加了使用成本，且只能针对单种活体细菌进行检测。中国专利技术专利申请(申请公开号：CN103048316A，申请公开日：2013-04-17)公开了生牛乳细菌总数检测膜制作方法及检测方法。利用二次浸渍、干燥成膜的方式制备得到的细菌检测膜，优点是为生牛乳初期的收集过程中提供了一种快速、有效及方便的细菌总数测定方法，缺点是检出精度不够，只能区分样本细菌含量是否在3×105～20×105CFU/ml的范围内，不能细分细菌浓度，适用样本中活体细菌总数初步检测。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术公开了一种能够快速准确检测细菌浓度的荧光型细菌检测膜和制备方法及其检测方法。为实现上述目的，苯专利技术公开了一种荧光型细菌检测膜，它还包括设置在所述基材层上的检测层，所述基材层由纳米纤维膜组成，所述检测层由功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物组成，所述功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物通过层层自组装的方式均匀交替组装设置在所述纳米纤维膜表面，所述功能性阳离子聚合物为甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物，其分子式如式I所示，所述阴离子聚合物为聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种；其中，上述式I分子的制备过程如下式II所示：上述式I中，x:y的数值介于1:9～1:19之间，优选，x:y＝1:10、x:y＝1:11、x:y＝1:12、x:y＝1:13、x:y＝1:14、x:y＝1:15、x:y＝1:16、x:y＝1:17、x:y＝1:18；保证在对细菌的高精度识别基础上，分子的荧光强度较强，提高检测仪器的灵敏度。进一步地，所述层层自组装的作用力为静电吸附作用力，所述纳米纤维膜的表面静电吸附甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物分子的一端，所述共聚物分子的另一端静电吸附聚丙烯酸分子的一端或聚甲基丙烯酸分子的一端。再进一步地，所述纳米纤维膜为聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜，所述聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜的厚度为100～300μm，克重为12～40gsm。为了更好的实现上述目的，本专利技术还公开了制备上述的荧光型细菌检测膜的方法，包括如下步骤：1)制备纳米纤维膜：在普通无纺布的表面均匀喷淋聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液，成膜后干燥，分离即制备得到聚乙烯醇-聚乙烯的纳米纤维膜；2)制备表面活化的纳米纤维膜：将所述步骤1)制备得到的纳米纤维膜浸渍在氢氧化钠溶液中一段时间，即得到表面活化的纳米纤维膜；3)制备细菌检测膜：将所述步骤2)制备得到的表面活化的纳米纤维膜浸渍于共聚物的水溶液中一段时间后，取出并采用清水洗净后，再置于聚丙烯酸水溶液或聚甲基丙烯酸水溶液中浸渍处理一段时间，取出并采用清水洗净，依次交替重复五次浸渍在上述共聚物的水溶液和聚丙烯酸水溶液或聚甲基丙烯酸水溶液中，最后干燥即制备得到细菌检测膜。进一步地，所述步骤3)中，所述功能性阳离子聚合物溶液的浓度为1～4g/L，pH值为4～7，浸渍处理时间为10～30min。再进一步地，所述步骤3)中，所述聚丙烯酸水溶液或聚甲基丙烯酸水溶液的浓度为1～4g/L，pH值为6～7，浸渍处理时间为10～30min。更进一步地，所述步骤2)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5～2.5mol/L，浸渍处理的时间为10～30min。作为本专利技术的技术优选，纳米纤维膜的厚度为200μm，克重为25gsm，若纳米纤维膜的厚度太薄，克重数太小，基材层不能起到对检测层的有效支撑，若纳米纤维膜的厚度太厚，克重数太大，基材层对检测层也就失去了有效支撑的意义。室温下功能性阳离子聚合物溶液的浓度为3g/L，pH为5，浸渍处理时间为20min，这是因为在典型的静电吸附自组装过程中，聚电解质的浓度一般要达到1g/L以上，该浓度比朗缪尔吸附等温线平稳段所需的浓度大，若溶液浓度太低、浸渍时间太短将会导致吸附的细菌检测层不平整和检测能力下降；若浓度太高、浸渍时间太长对细菌检测层的吸附没有太大的意义，还会造成原料的浪费和时间成本的增加。而聚电解质溶液的酸度值一般要达到4～7，若酸性太强，环境中大量分布的氢离子对甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物的季胺盐分子的质子化过程无明显促进作用；若碱性太强，氢氧根离子的大量分布将抑制甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物的季胺盐分子的质子化，引起甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物的季胺盐分子失去涂敷能力，从而导致涂覆的细菌检测层的不平整和检测能力下降。室温下阴离子聚合物的浓度在3g/L，酸度值在7之间，浸渍处理的时间为20min。若溶液浓度太低、浸渍时间太短将会导致吸附的细菌检测层的不平整和检测能力下降；若浓度太高、浸渍时间太长对细菌检测层的吸附也没有太大的意义，还会造成原料的浪费和时间成本的增加。聚合物溶液的酸度值一般要达到6～7，酸性太强的环境将引起自身电性的逆转，导致吸附的细菌检测层的不平整和检测能力下降；碱性太强的环境会破坏纳米纤维膜基材层，导致吸附的细菌检测层的不平整和检测能力下降。氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸渍处理的时间为30min，采用氢氧化钠溶液进行活化处理的目的是使纳米纤维膜表面的羟基暴露，并在环境中显示一定的电负性，若氢氧化钠溶液的浓度太低，浸渍处理的时间太短，会导致纳米纤维膜表面的羟基既不能完全充分的暴露，又不能很好的形成平整的表面，影响后续吸附阴离子聚合物的效果，若氢氧化钠溶液的浓度太高，浸渍处理的时间太长，会大大的降低纳米纤维膜表面的结构强度，也不利于后期阴离子聚合物的吸附效果。为了更好的实现本专利技术的目的。本专利技术还公开了一种细菌检测的方法，包括如下步骤：a)选用上述制备的检测膜并测定其膜表面的荧光强度值；b)取待测样品滴加到所述步骤a)选用的检测膜上；c)分别在相等的时间间隔之间测定检测膜表面的荧光强度变化值，并根据荧光强度变化值计算荧光强度的变化速率；d)根据所述步骤c)荧光强度的变化速率，结合标准曲线得到待测样品中的细菌浓度。更进一步地，所述步骤d)中标准曲线的绘制过程为：取五份大肠杆菌悬浮液的浓度为10CFU/mL、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光型细菌检测膜，包含基材层，其特征在于：它还包括设置在所述基材层上的检测层，所述基材层由纳米纤维膜组成，所述检测层由功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物组成，所述纳米纤维膜的表面通过静电作用力依次交替吸附所述功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物若干次，得到荧光型细菌检测膜；所述功能性阳离子聚合物为甲基丙烯酸N,N‑二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物，其分子结构式如式I所示，所述阴离子聚合物为聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种；

【技术特征摘要】
1.一种荧光型细菌检测膜，包含基材层，其特征在于：它还包括设置在所述基材层上的检测层，所述基材层由纳米纤维膜组成，所述检测层由功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物组成，所述纳米纤维膜的表面通过静电作用力依次交替吸附所述功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物若干次，得到荧光型细菌检测膜；所述功能性阳离子聚合物为甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物，其分子结构式如式I所示，所述阴离子聚合物为聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种；2.根据权利要求1所述的荧光型细菌检测膜，其特征在于：所述式I中，x:y＝1:9～1:19。3.根据权利要求1所述的荧光型细菌检测膜，其特征在于：所述纳米纤维膜的表面通过静电作用力吸附功能性阳离子聚合物的一端，所述功能性阳离子聚合物的另一端通过静电作用力吸附阴离子聚合物，依次交替吸附所述功能性阳离子聚合物和阴离子聚合物各5次。4.根据权利要求1所述的荧光型细菌检测膜，其特征在于：所述纳米纤维膜为聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜，所述聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维膜的厚度为100～300μm，克重为12～40gsm。5.一种权利要求1所述的荧光型细菌检测膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)制备纳米纤维膜：在普通无纺布的表面均匀喷淋聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液，成膜后干燥，分离即制备得到聚乙烯醇-聚乙烯的纳米纤维膜；2)制备表面活化的纳米纤维膜：将所述步骤1)制备得到的纳米纤维膜浸渍在氢氧化钠溶液中活化处理得到表面活化的纳米纤维膜；3)制备细菌检测膜：将所述步骤2)制备得到的表面活化的纳米纤维膜浸渍于甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和氟硼荧类荧光分子的共聚物的水溶液中处理，取出并采用清水洗净后，再置于聚丙烯酸水溶液或聚甲基丙烯酸水溶液中浸渍处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：王栋，鲁振坦，余振国，黄煜，刘琼珍，
申请(专利权)人：武汉纺织大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42