甜菊醇糖苷类的重组生产制造技术

本申请涉及甜菊醇糖苷类的重组生产。本发明专利技术公开了经过改造能够表达编码UDP‑糖基转移酶(UGT)之重组基因的重组微生物、植物和植物细胞。这样的微生物、植物或植物细胞可以产生甜菊醇糖苷类，例如莱鲍迪苷A和/或莱鲍迪苷D，其可用作食品中的天然甜味剂和膳食补充剂。

Recombinant production of steviol glycosides

This application involves recombinant production of steviol glycosides. The present invention discloses recombinant microorganisms, plants and plant cells capable of expressing recombinant genes encoding UDP glycosyltransferase (UGT). Such microorganisms, plants or plant cells can produce stevioside glycosides, such as rebaudioside A and/or rebaudioside D, which can be used as natural sweeteners and dietary supplements in foods.

【技术实现步骤摘要】
甜菊醇糖苷类的重组生产本申请是申请日为2012年8月8日、申请号为“201280038853.3”、专利技术名称为“甜菊醇糖苷类的重组生产”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2012/050021的中国国家阶段申请。相关申请的交叉引用本申请要求以下申请的优先权：2011年8月8日提交的美国申请序列号61/521,084；2011年8月8日提交的美国申请序列号61/521,203；2011年8月8日提交的美国申请序列号61/521,051；2011年8月15日提交的美国申请序列号61/523,487；2011年12月7日提交的美国申请序列号61/567,929以及2012年2月27日提交的美国申请序列号61/603,639，其全部通过引用整体并入本文。
本公开内容涉及甜菊醇糖苷类(steviolglycosides)的重组生产。具体地，本公开内容涉及通过重组宿主例如重组微生物、植物或植物细胞来生产甜菊醇糖苷类例如莱鲍迪苷(rebaudioside)D。本公开内容还提供了包含甜菊醇糖苷类的组合物.本公开内容还涉及用于通过调节角鲨烯(squalene)途径的类萜前体之生物合成来生产类萜的工具和方法。
技术介绍
甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂或者作为烘培中糖的家用替代品来单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物是可以从常青灌木甜叶菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的一种天然甜味剂。甜菊在南美和亚洲被广泛种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及共混或单独地作为佐餐甜味剂。甜菊植物的提取物含有莱鲍迪苷和其他带来甜味的甜菊醇糖苷类，但不同产品批次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商品中占优势的是莱鲍迪苷A，和量少一些的其他糖苷，例如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可能含有杂质，例如造成异味的来源于植物的化合物。这些异味根据食物系统或应用选择可能会带来或多或少的问题。潜在的杂质包括色素、脂质、蛋白质、酚类、糖类、斯巴醇和其他倍半萜、半日花烷型二萜、单萜、癸酸、8,11,14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆留醇(stigmasterol)、β-谷留醇(β-sitosterol)、α-和β-香树素(α-andβ-amyrin)、羽扇豆醇酯(lupeol)、β-香树醇乙酸酯(β-amryinacetate)、五环三萜、centauredin、槲皮素(quercitin)、表-α-杜松醇(epi-alpha-cadinol)、carophyllenes和衍生物、β-蒎烯(beta-pinene)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)以及赤霉素(gibberellin)。
技术实现思路
本专利技术提供了重组宿主，例如微生物、植物或植物细胞，其包含一个或更多个生物合成基因，这些基因的表达导致产生甜菊醇糖苷类，例如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷(dulcoside)A。特别地，EUGT11(本文所述的一种尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶)可单独使用或者与一种或更多种其他UDP糖基转移酶例如UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2和UGT91D2e组合使用以允许莱鲍迪苷D在重组宿主中产生和累积或者使用体外系统。如本文所述，EUGT11具有强1，2-19-O-葡萄糖糖基化活性，其为莱鲍迪苷D产生的一个重要步骤。通常来说，甜菊苷(stevioside)和莱鲍迪苷A是在商业上生产的甜菊提取物中的主要化合物。据报道，甜菊苷的味道比莱鲍迪苷A更苦并且甜味更小。根据种植植物的土壤和气候，甜菊提取物的组成可大不相同。据报道，根据植物来源、气候条件和提取工艺，商业制备物中莱鲍迪苷A的量为甜菊醇糖苷类总含量的20％至97％不等。在甜菊提取物中，其他甜菊醇糖苷类以多种量存在。例如，莱鲍迪苷B通常以小于1％至2％存在，而莱鲍迪苷C可以以高至7％-15％的水平存在。莱鲍迪苷D通常以2％或更低的水平存在，莱鲍迪苷F通常在组合物中以总甜菊醇糖苷类的3.5％或更低存在。次要甜菊醇糖苷类的量影响甜菊提取物的风味特征(flavorprofile)。此外，认为莱鲍迪苷D和其他较高糖化甜菊醇糖苷类是与莱鲍迪苷A相比质量更高的甜味剂。因此，本文所述的重组宿主和方法特别可用于生产具有增加量的莱鲍迪苷D的甜菊醇糖苷类组合物，该甜菊醇糖苷类组合物例如用作无热量的甜味剂，其功能特性和感觉特性优于许多高效甜味剂。在一个方面中，本文描述了这样的重组宿主，其包含编码与SEQIDNO：152中所示氨基酸序列具有至少80％同一性之多肽的重组基因。本文的特征还在于这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至甜叶悬钩子苷(rubusoside)之19-O-葡萄糖的C-2'处之能力的多肽的重组基因.本文的特征还在于这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至甜菊苷(stevioside)之19-O-葡萄糖的C-2'处之能力的多肽的重组基因。在另一个方面中，本文描述了这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至甜叶悬钩子苷之19-O-葡萄糖的C-2'处和转移至甜叶悬钩子苷之13-O-葡萄糖的C-2'处之能力的多肽的重组基因。本文还描述了这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至莱鲍迪苷A之19-O-葡萄糖的C-2'处以产生莱鲍迪苷D之能力的多肽的重组基因，其中当反应在相应条件下进行时，该多肽的催化速率比具有SEQIDNO：5中给出之氨基酸序列的91D2e多肽快至少20倍(例如，快25倍或30倍)。在本文所述的任意重组宿主中，所述多肽与SEQIDNO：152中所示氨基酸序列可以具有至少85％的序列同一性(例如，90％、95％、98％或99％序列同一性)。所述多肽可以具有SEQIDNO：152中所示氨基酸序列。本文所述的任意宿主还可以包含编码与SEQIDNO：3中所示氨基酸序列具有至少90％同一性之UGT85C多肽的重组基因。UGT85C多肽可以包含位于SEQIDNO：3的第9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444以及471位残基处的一个或更多个氨基酸替换。本文所述的任意宿主还可以包含编码与SEQIDNO：7中所示氨基酸序列具有至少90％同一性之UGT76G多肽的重组基因。UGT76G多肽可以具有位于SEQIDNO：7的第29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基处的一个或更多个氨基酸替换。本文所述的任意宿主还可以包含编码UGT74G1多肽的基因(例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物的方法，其包括使包含甜菊醇、前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物的起始组合物与以下的一种或更多种：a)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13‑O‑葡萄糖、19‑O‑葡萄糖或者13‑O‑葡萄糖和19‑O‑葡萄糖二者的C2’处进行β1，2‑糖基化；b)多肽，其能够对甜菊醇13‑O‑单糖苷进行鼠李糖基化；c)尿苷5’‑二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT74家族包括UGT74G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C‑19羧基处糖基化；d)尿苷5’‑二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT85家族包括UGT85G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C‑13羟基处糖基化；和/或e)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13‑O‑葡萄糖、19‑O‑葡萄糖或者13‑O‑葡萄糖和19‑O‑葡萄糖二者的C3’处进行β1，3‑糖基化；其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；以及一种或更多种UDP‑糖在适合一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP‑糖转移到所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上的反应条件下接触，从而产生所述靶甜菊醇糖苷类或所述靶甜菊醇糖苷类组合物。...

【技术特征摘要】
2011.08.08 US 61/521,084;2011.08.08 US 61/521,203;1.一种产生靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物的方法，其包括使包含甜菊醇、前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物的起始组合物与以下的一种或更多种：a)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化；b)多肽，其能够对甜菊醇13-O-单糖苷进行鼠李糖基化；c)尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT74家族包括UGT74G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化；d)尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT85家族包括UGT85G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化；和/或e)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化；其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；以及一种或更多种UDP-糖在适合一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上的反应条件下接触，从而产生所述靶甜菊醇糖苷类或所述靶甜菊醇糖苷类组合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种UDP-糖包括UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、果糖和/或UDP-木糖。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶甜菊醇糖苷类包括甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜尔可苷A、甜菊醇单葡萄糖苷、甜菊醇鼠李糖苷或甜菊醇木糖苷。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶甜菊醇糖苷类组合物包含甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜尔可苷A、甜菊醇单葡萄糖苷、甜菊醇鼠李糖苷和/或甜菊醇木糖苷、或者其组合。5.根据权利要求1所述的方法，其中a)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊苷或莱鲍迪苷B、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷A；或者b)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷或甜菊醇-1，2-二糖苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷B；或者c)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、或甜菊苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷E；或者d)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、或莱鲍迪苷E、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷D；或者e)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、或甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖，所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或鼠李糖合成酶(RHM2)多肽相接触；并且在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生杜尔可苷A；或者f)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷、或杜尔可苷A、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖，所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、鼠李糖合成酶(RHM2)多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷C；或者g)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、1，2-甜菊醇木糖苷、或甜菊醇-1，2-木糖二苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖和UDP-木糖，所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD1)多肽、和/或UDP-葡糖醛酸脱羧酶(UXS3)多肽；并且在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-葡萄糖和UDP-木糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷F。6.根据权利要求1所述的方法，其中在已转化有编码所述能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽之基因的通透化重组宿主细胞中产生所述靶甜菊醇糖苷类或所述靶甜菊醇糖苷类组合物，所述基因与SEQIDNO：152中所示氨基酸序列具有至少80％的同一性。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是体外方法，其还包括提供所述一种或更多种UDP-糖和/或无细胞系统用于所述一种或更多种UDP-糖的再生。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述体外方法是酶促体外方法或全细胞体外方法。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述全细胞体外方法包括将包含所述一种或更多种UDP-糖和一种或更多种底物的原材料喂食给全细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其中用于所述全细胞体外方法的全细胞具有降低的降解外源蔗糖的能力。11.根据权利要求9所述的方法，其中用于所述全细胞体外方法的全细胞包含一种或更多种编码以下的重组基因：蔗糖合酶(SUS)多肽、蔗糖转运蛋白多肽、鼠李糖合成酶(RHM2)多肽、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD1)多肽、或UDP-葡糖醛酸脱羧酶(UXS3)多肽。12.根据权利要求11所述的方法，其中(a)所述蔗糖转运蛋白多肽由拟南芥(Arabidopsisthaliana)SUS1基因或其功能同源物编码；(b)所述SUS多肽由小果咖啡(Coffeaarabica)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)或甜叶菊(Steviarebaudiana)SUS1基因或其功能同源物编码；(c)所述RHM2多肽包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)RHM2多肽；(d)所述UGD1多肽包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)UGD1多肽或新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)UGD1多肽；和/或(e)所述UXS3多肽包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)UXS3多肽或新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)UXS3多肽。13.根据权利要求11所述的方法，其中(a)所述蔗糖转运蛋白多肽包括与SEQIDNO：179中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的蔗糖转运蛋白多肽；和/或(b)所述SUS多肽由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQIDNO：175-177中任一个所示核苷酸序列具有至少90％的同一性，或者所述SUS多肽的氨基酸序列与SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：延斯·霍顿拉森，保拉·M·希克斯，迈克尔·内斯比，通格·托马斯·厄斯特高，约恩·汉森，迈克尔·达尔格德米克尔森，汉森·埃斯本·哈尔克耶尔，埃内斯托·西蒙，萨比娜·德安德雷德佩雷拉塔瓦雷斯，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH