一种5`端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用。该制备方法包括如下步骤：(1)在目的DNA两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体；(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。本发明专利技术制备方法步骤简单、成本低廉，磷酸化效率高，所得5'端磷酸化单链DNA易于表征和纯化，将其应用于基因编辑、靶向定位和/或调控可以显著提高效率，具有广阔的应用前景。

Preparation and application of 5` terminal phosphorylated single chain DNA

The invention discloses a method for preparing 5'terminal phosphorylated single chain DNA and its application. The preparation method comprises the following steps: (1) inserting a restriction endonuclease digestion site sequence at both ends of the target DNA to form a stem-ring structural precursor; (2) dissolving the stem-ring structural precursor obtained by step (1) dissolving the stem-ring structural precursor in a buffer solution and annealing to obtain a stem-ring structural solution; (3) adding a limit to the stem-ring structural solution obtained by step (2) The restriction endonuclease was inactivated and the digested product was obtained after the treatment of the producing endonuclease. (4) The digested product was recovered from step (3). The preparation method of the invention has the advantages of simple steps, low cost, high phosphorylation efficiency, easy characterization and purification of the 5'-terminal phosphorylated single-stranded DNA, and can be applied to gene editing, targeted localization and/or regulation, which can significantly improve the efficiency and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种5’端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体地涉及一种5'端磷酸化单链DNA(5'P-ssDNA)的制备方法及其应用。
技术介绍
近年来，以CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)技术为代表的新一代基因编辑技术由于其精准的靶向性和易用性，在生物学基础研究和生物医学应用中已经展现出不可估量的潜力。这类基因编辑系统通常利用了细菌中天然存在的防御机制，实现对入侵DNA的靶向剪切。除了CRISPR系统的Cas9系列限制性内切酶(也简称内切酶)之外，一些基于其他内切酶(例如Argonaute)的基因编辑系统也受到了广泛的关注。该类内切酶采用5'磷酸化的单链DNA作为"引导"(guideDNA，gDNA)来帮助核酸酶识别目标基因序列并对其进行剪切。与CRISPR系统相比，这类系统采用短单链DNA而非RNA作为引导分子，无需构建用于RNA表达的质粒，更加易于人工合成和直接转染。目前，商业化的单链DNA化学合成技术已经非常成熟且价格低廉，使得利用单链DNA(ssDNA)作为引导的基因编辑系统在成本上比利用RNA的CRISPR系统更有优势。更重要的是，常规的CRISPR系统要求目标区域下游具有特定的PAM序列，而Argonaute系统无类似限制，几乎可用于针对任何目标序列。但是，与天然的DNA末端不同，默认条件合成的单链DNA5'端没有引入磷酸基团。为了获得可用于基因编辑系统的引导DNA，我们需要对化学合成的单链DNA进行合成后的5'端磷酸化修饰。因此，磷酸化的效率就成为了影响基因编辑效率的关键因素之一。目前已有的某些研究表明，由商业化的引物合成服务提供的化学磷酸化修饰方法所获得的5'-PssDNA在基因编辑应用当中对目标基因的剪切效率不佳，而用T4核酸激酶催化的磷酸化修饰也存在效率难以优化、修饰产物难以表征和纯化的问题。此外，基因工程中常用的经典DNA限制性内切酶催化的剪切反应通常识别并作用于DNA双链，剪切产物也是双链，因此不适合直接用于单链DNA的5'磷酸化。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的磷酸化效率低、剪切效率不佳等困难提供一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法及其应用。该制备方法具有操作简便、磷酸化效率高、适用范围广以及应用前景广阔等优点。本专利技术解决上述问题的技术方案之一是：一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法，其包括如下步骤：(1)在目的DNA两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体，其中所述目的DNA位于茎环结构前体的环状单链区域，所述酶切位点序列位于茎环结构前体的茎部双链区域；(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。较佳地，步骤(1)中所述酶切位点序列含有限制性内切酶的识别序列及酶切位点，所述的限制性内切酶的酶切位点与识别序列分离；更佳地，酶切位点位于识别序列下游，因此对酶切位点下游的产物5’端序列没有限制，茎环结构在限制性内切酶作用下被切断，释放5'端带有磷酸基团的目的DNA，即所述酶切位点序列与相邻的目的DNA的碱基具有如下序列：5'-S1N1N2N3-3'3'-S2N4N5N6-5'；所述S1为限制性内切酶的识别序列的正向序列，所述S2为限制性内切酶的识别序列的反向序列，所述N1、N2为目的DNA3’末端两个碱基的反向互补序列，N3-N6为目的DNA的碱基，所述酶切位点位于N2和N3之间以及S2和N4之间。较佳地，所述的酶切位点序列还含有保护碱基序列，其中S1的5’端具有保护碱基序列1，S2的3’端具有保护碱基序列2，保护碱基序列1与保护碱基序列2反向互补；较佳地，所述保护碱基序列为含有3-6个碱基的GC含量高的序列，其中GC含量高的保护碱基序列用于确保茎环结构形成，保证剪切效率；进一步较佳地，所述的保护碱基序列1为：GCGC、GGGC或者CCCG。所述限制性内切酶为本领域常规的酶切位点与识别序列分离的限制性内切酶。较佳地，所述限制性内切酶为BseGI/BstF5I/BtsCI、BtsαI/BtsI、BtsIMutI或者Bse3DI/BseMI/BsrDI酶，上述4组酶的识别序列(下划线)以及酶切位点(箭头位置)分别为：本专利技术通过选用酶切位点位于识别序列下游的限制性内切酶，使得对酶切位点下游的产物5'端序列没有限制，可用于制备几乎任意序列的5'P-ssDNA。步骤(2)中所述缓冲液为本领域处理核苷酸序列所用常规的缓冲液，通常选用限制性内切酶供应商产品说明书所提供的。在本专利技术一较佳实施例中，限制性内切酶选用BseGI，目的DNA两端带有限制性内切酶BseGI识别序列的茎环结构前体序列为：5'-GCGCGGATG+目的DNA3’末端两个碱基的反向互补序列N1N2+目的DNA+CATCCGCGC-3'，其中斜体的GCGC为保护碱基序列。其中，所述缓冲液由BseGI酶供应商产品说明书提供，含有下列成分：MgCl25mM，Tris-HCl10mM，DNA10μM；pH8.0。所述退火处理为本领域常规；较佳地，所述退火处理为热循环仪95℃处理5分钟，然后迅速降温至4℃，并保持10分钟。步骤(3)中所述限制性内切酶处理以及限制性内切酶失活为本领域常规；较佳地，所述酶活单位为8-15U，所述限制性内切酶处理为33-38℃处理12小时以上；更佳地，所述酶活单位为10U，所述限制性内切酶处理为37℃处理12小时。使限制性内切酶BseGI失活的方法为本领域常规，较佳地，所述的使限制性内切酶失活为60-68℃处理茎环结构溶液15-25分钟；更佳地，所述的使限制性内切酶失活为65℃处理茎环结构溶液20分钟。步骤(4)中所述回收为本领域常规，较佳地为电泳回收；更佳地，所述电泳为非变性凝胶电泳，最佳地，所述非变性凝胶电泳为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳。本专利技术解决上述问题的技术方案之二是：一种基于内切酶的基因编辑、靶向定位和/或调控方法，其包括：将用于表达Argonaute系统内切酶蛋白的质粒与通过上述制备方法制得的5'端磷酸化单链DNA共转染到所要基因编辑、靶向定位和/或调控的细胞当中，进行基因编辑、靶向定位和/或调控操作；较佳地，所述内切酶为NgAgo。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实施例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：(1)步骤简单，成本低廉：含有酶切位点的DNA茎环结构设计简单，无需合成双链DNA，在目的序列两段加入固定序列，利用常规的单链引物合成服务即可获得带有茎环结构的前体；同时，切割的产物也是DNA单链，无需通过双链变性或非对称PCR获得；(2)磷酸化效率高：剪切效率等于磷酸化的效率，限制性内切酶剪切后的DNA的5'端必然带有磷酸基团，因此可以制备100％磷酸化的单链DNA；(3)易于表征和纯化：限制性内切酶处理后的产物用凝胶电泳即可进行验证和分离；(4)适用范围广：对目的DNA序列无特殊要求，不受限本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法，其包括如下步骤：(1)在目的DNA两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体，其中所述目的DNA位于茎环结构前体的环状单链区域，所述酶切位点序列位于茎环结构前体的茎部双链区域；(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。

【技术特征摘要】
1.一种5'端磷酸化单链DNA的制备方法，其包括如下步骤：(1)在目的DNA两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体，其中所述目的DNA位于茎环结构前体的环状单链区域，所述酶切位点序列位于茎环结构前体的茎部双链区域；(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶切位点序列含有限制性内切酶的识别序列及酶切位点，所述的酶切位点能与识别序列分离；较佳地，所述限制性内切酶的酶切位点位于识别序列下游，即所述酶切位点序列与相邻的目的DNA的碱基具有如下序列：5’-S1N1N2N3-3’3’-S2N4N5N6-5’；所述S1为限制性内切酶的识别序列的正向序列，所述S2为限制性内切酶的识别序列的反向序列，所述N1、N2为目的DNA3’末端两个碱基的反向互补序列，N3-N6为目的DNA的碱基，所述酶切位点位于N2和N3之间以及S2和N4之间。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的酶切位点序列还含有保护碱基序列，其中S1的5’端具有保护碱基序列1，S2的3’端具有保护碱基序列2，保护碱基序列1与保护碱基序列2反向互补；较佳地，所述的保护碱基序列为含有3-6个碱基的GC含量高的序列；更佳地，所述的保护碱基序列1为：GCGC、GGGC或者CCCG。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的限制性内切酶为BseGI、BstF5I或BtsCI酶，所述的S1序列为GGATG，S2序列为CCTAC；或者，所述的限制性内切酶为BtsαI或BtsI酶，所述的S1序列为GCAGTG，S2序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，王丽华，李江，诸兵，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31