一种检测全局调控因子IrrE蛋白及其转基因农作物的金标试纸条制造技术

本发明专利技术提供了一对杂交瘤细胞株，该对杂交瘤细胞株包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12271。本发明专利技术还提供了由这两株杂交瘤细胞分泌的一对配对单克隆抗体和它们在检测转IrrE的转基因农作物中的用途以及一种免疫胶体金试纸条和检测转IrrE的转基因农作物的方法。通过上述技术方案，本发明专利技术能够通过免疫胶体金试纸条，对IrrE蛋白的检测取得1ng/mL的灵敏度，对28种非转基因作物和16种不同来源的各种非IrrE转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的灵敏度和特异性。

Gold standard test strip for detecting global regulation factor IrrE protein and its transgenic crops

The present invention provides a pair of hybridoma cell lines comprising a first hybridoma cell line and a second hybridoma cell line stored independently; the first hybridoma cell line is preserved as CGMCC NO. 12270; and the second hybridoma cell line is preserved as CGMCC NO. 12271. The invention also provides a pair of paired monoclonal antibodies secreted by the two hybridoma cells and their use in detecting transgenic crops with IrrE, and an immunogold test strip and a method for detecting transgenic crops with IrrE. Through the above-mentioned technical scheme, the invention can obtain 1ng/mL sensitivity for the detection of IrrE protein by immunocolloidal gold test strip, and does not cross-react with 28 kinds of non-transgenic crops and 16 kinds of non-IrrE transgenic crops from different sources, thus having higher sensitivity and specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种检测全局调控因子IrrE蛋白及其转基因农作物的金标试纸条
本公开涉及农业生物
，具体地，涉及一种杂交瘤细胞对、一种单克隆抗体对、该单克隆抗体对在检测IrrE蛋白中的用途以及一种免疫胶体金试纸条。
技术介绍
耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)是迄今发现对包括电离辐射、过氧化氢、紫外线辐射、丝裂霉素C和干旱等多种DNA损伤试剂都有很强的抗性的细菌菌株。1999年美国基因组研究所完成了耐辐射异常球菌全基因组测序，为其抗性机制的研究打下重要的理论基础。研究发现，耐辐射异常球菌中irrE基因编码异常球菌属特异蛋白，是该菌属特有的、极其重要的DNA修复保护途径的开关基因，对DNA损伤修复起重要的作用。该基因突变造成菌株多种胁迫抗性丧失。研究认为irrE基因是一种新型的负责极端胁迫抗性的启动基因，在各种DNA损伤修复和保护极端胁迫反应的途径中起中心调控作用。将IrrE在大肠杆菌中组成型表达，使得大肠杆菌的电离辐射抗性提高近1.6倍。IrrE对电离辐射后大肠杆菌中RecA蛋白的表达起诱导作用。同时增强了电离辐射后细胞中过氧化氢酶KatG的活性，进而提高了细胞对氧自由基的清除能力。在3M山梨醇冲击、1％过氧化氢冲击以及53℃高温冲击等非生物胁迫实验结果表明，IrrE具有提高大肠杆菌渗透胁迫、氧化胁迫和高温胁迫的功能。同时，还发现了IrrE能提高大肠杆菌的耐盐能力。利用花椰菜花叶病毒35S启动子将IrrE蛋白在油菜中过量表达。表达IrrE的转基因油菜在萌发、生长、开花、结子等生长过程与对照植株没有差别，但表现出极好的耐盐抗旱能力。转基因植株能够在350mM氯化钠处理6周后正常的开花结子，而对照植物在处理2周时已全部死亡。研究发现高浓度盐胁迫下表达IrrE的转基因植株中胁迫诱导蛋白CBF1和CBF3、质膜钠转运蛋白SOS1以及超氧化物歧化酶SOD表达显著上调。推测全局调控因子IrrE通过直接或间接上调这些蛋白的表达，从而提高了转基因植株的耐盐抗旱能力。现代生物技术的发展为利用外源基因培育新种农作物提供了途径。在转基因产品的研发、筛选或安全评估时，需要转基因生物检测技术对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。现有的检测技术，如酶免法、放免法等，需要特殊的仪器设备(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)和专用的场地等，检测时间长(酶免检测时间需2h、放免检测需3h左右)，检测成本较高，需要专业的操作人员进行检测，实践推广应用的空间有限。因此，需要有一种操作简便、结果准确可靠、可快速检测转基因植物中IrrE蛋白的装置。免疫结合胶体金层析法是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种应用形式。免疫结合胶体金层析法利用抗原抗体反应的原理，包括双抗体夹心法、双抗原夹心法、捕获法和竟争抑制法等实施方法，其中，以双抗体夹心法应用最为广泛。双抗体夹心法利用一对针对不同抗原表位的抗体，检测有多个抗原位点的生物分子。具体实施的技术方案如下：首先将已知的特异性抗体(单抗或多抗)按一定的浓度包被于微孔膜上作为检测带，可与金标物结合的二抗包被于膜上作为质控带。使用胶体金标记与包被抗体相配对的另一单抗，形成的金标结合物涂布于金标垫上并进行干燥。干燥的金标垫的两端分别连接膜与样品垫。膜的另一侧粘贴吸水垫。检测时，在样品垫上加入一定量的液体样本，借助毛细管作用，样本向吸水垫的方向移动。首先经过干燥金标垫，复溶金标结合物，如标本中有待测抗原，则发生抗原抗体反应，形成复合物A(金颗粒－抗体－抗原)；样本继续移动到达检测带位置，则与包被抗体再次发生抗原抗体反应，形成复合物B(金颗粒－抗体－抗原－包被抗体)，并于检测带的部位聚集，最终达到肉眼可见的程度，如样本中无待检抗原或待检抗原的浓度低于检测范围，则不能形成肉眼可见的红色条带。游离的金标结合物或复合物A越过检测带到达质控带，与二抗发生反应，形成复合物C(金颗粒－抗体－二抗)，聚集并产生肉眼可见的红色条带。无论样本中是否含有待检物质，质控带都会呈现红色条带。免疫结合胶体金层析法具有操作简单、快速、可单份检验、不需要特殊设备的优点。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在一定缺陷，如敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等。因此，提高抗单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重要手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏特异的免疫结合胶体金层析法检测转IrrE的转基因农作物的方法。为了实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12271。再一方面，本专利技术还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12271。再一方面，本专利技术还提供了如上所述的单克隆抗体对在检测转IrrE的转基因农作物中的用途。再一方面，本专利技术还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有质控线(C线)和检测线(T线)，所述C线上包被有抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克隆抗体对为如上所述的单克隆抗体对。再一方面，本专利技术还提供了一种检测转IrrE的转基因农作物的方法，其中，该方法包括如下步骤：S1、从待检测的农作物中提取全蛋白；S2、对所述全蛋白使用如上所述的单克隆抗体对进行免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测；S3、如果免疫胶体金试纸检测或双抗夹心酶连免疫检测的结果中出现IrrE的阳性结果，则指示待检测的农作物为转IrrE的转基因农作物。通过上述技术方案，本专利技术能够通过免疫胶体金试纸，对IrrE蛋白的检测取得1ng/mL的灵敏度，对28种非转基因作物和16种不同来源的各种非IrrE转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物材料保藏本专利技术的第一杂交瘤细胞株是本专利技术的专利技术人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCCNO.12270，保藏日期为2016年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗IrrE单克隆抗体杂交瘤细胞株。本专利技术的第二杂交瘤细胞株是本专利技术的专利技术人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCCNO.12271，保藏日期为2016年04月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗IrrE单克隆抗体杂交瘤细胞株。附图说明附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.12271。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12271。2.一种单克隆抗体对，其特征在于，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12270；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.12271。3.权利要求2所述的单克隆抗体对在检测转IrrE的转基因农作物中的用途。4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述农作物为花椰菜、油菜、棉花、玉米、水稻或大豆。5.一种免疫胶体金试纸条，该免疫胶体金试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体；所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体对为权利要求2所述的单克隆抗体对。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：周正富，张维，刘奇，郑健，陈明，林敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11