一种用于人细胞程序性死亡-配体1蛋白的酶联免疫检测及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种酶联免疫及其检测方法，是一种新的抗人细胞程序性死亡‑配体1蛋白的单抗包被酶标板及酶联免疫试剂盒的制备方法。其关键之处主要在于用基因工程方法制备特异性的鼠抗人细胞程序性死亡‑配体1蛋白的单抗，并将此抗体纯化后包被于酶标板上，做为试剂盒的一部分。试剂盒还包括人细胞程序性死亡‑配体1的重组蛋白标准品、抗人细胞程序性死亡‑配体1蛋白的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、抗体稀释液、显色液、终止液。试剂盒建立了快捷简便测定人血清和血浆中人细胞程序性死亡‑配体1蛋白浓度的测定方法。试剂盒主要用于供科学研究和临床实验的研究使用。

An enzyme-linked immunosorbent assay and its preparation method for human cell programmed death ligand 1 protein

The invention relates to an enzyme-linked immunoassay (ELISA) and its detection method, and is a preparation method of a novel monoclonal antibody coated with a human programmed cell death ligand 1 protein and an ELISA kit. The key lies in the preparation of specific mouse anti-human programmed cell death ligand 1 protein monoclonal antibody by genetic engineering, and the purified antibody is coated on the enzyme label plate as part of the kit. The kit also includes recombinant protein standard for human programmed cell death ligand 1, polyclonal antibody against human programmed cell death ligand 1 protein, horseradish peroxidase labeled secondary antibody, sample diluent, antibody diluent, chromogenic solution, terminating solution. A rapid and simple method was developed for the determination of programmed cell death ligand 1 protein in human serum and plasma. The kit is mainly used for scientific research and clinical research.

【技术实现步骤摘要】
一种用于人细胞程序性死亡-配体1蛋白的酶联免疫检测及制备方法
本专利技术属于生物医药
，具体地说涉及一种检测人细胞程序性死亡-配体1蛋白的酶联免疫检测试剂盒。本专利技术还涉及上述试剂盒的制备方法。
技术介绍
细胞程序性死亡-配体1（PD-L1，programmedcelldeath-ligand1）即细胞程序性死亡-配体1，也可以称为CD274或者B7-H1，是由CD274基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白，理论分子量为33kDa，但经过剪切或糖基化等修饰后能检测到27-35kDa、45-50kDa和65-70kDa等多个分子量。人细胞程序性死亡-配体1蛋白具有较为广泛的表达谱，在胎盘、心脏、脾脏、胰腺、淋巴结和胸腺等组织均能检测到其转录本，主要由抗原呈递细胞APCS、活化的T细胞、B细胞、DC细胞和巨噬细胞等产生；此外，多种肿瘤组织或细胞也有较高的表达水平。人细胞程序性死亡-配体1蛋白是PD1的配体之一，在正常情况下，免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增殖，将外来抗原消灭；而PD1和人细胞程序性死亡-配体1蛋白结合后，可以传导抑制信号，减少T细胞的增殖，使产生免疫逃逸。由于肿瘤细胞可以表达人细胞程序性死亡-配体1蛋白，所以T细胞表面的PD1识别肿瘤细胞表面的人细胞程序性死亡-配体1蛋白后，传导抑制信号，导致T细胞不能发现肿瘤细胞，从而使肿瘤细胞逃避T细胞的攻击。因此，人细胞程序性死亡-配体1蛋白的表达情况与肿瘤的产生、发展、检测及死亡率有重要关系。SoominAhn等人通过对比正常人和甲状腺癌病人的人细胞程序性死亡-配体1蛋白表达量发现，病人体内的人细胞程序性死亡-配体1蛋白水平明显升高(SAhn,THKimetal.ComprehensivescreeningforPD-L1expressioninthyroidcancer[J].EndocrRelatCancer,2017,24(2):97-106)；S.Muenst研究发现人细胞程序性死亡-配体1蛋白的表达情况与乳腺癌的肿瘤大小、分级、淋巴结状态等密切相关，是乳腺癌预后的不利因素(MuenstS,SchaerliAR,GaoF,etal.Expressionofprogrammeddeathligand1(PD-L1)isassociatedwithpoorprognosisinhumanbreastcancer[J].BreastCancerResearchandTreatment,2014,146(1):15-24)；XavierFrigola研究表明人细胞程序性死亡-配体1蛋白的高水平表达预示着肾细胞癌的肿瘤更大、时期更晚、死亡率更高(FrigolaX,InmanBA,LohseCM,etal.IDENTIFICATIONOFASOLUBLEFORMOFB7-H1THATRETAINSIMMUNOSUPPRESSIVEACTIVITYANDISASSOCIATEDWITHAGGRESSIVERENALCELLCARCINOMA[J].ClinicalCancerResearchAnOfficialJournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch,2011,17(7):1915-23.)。此外，人细胞程序性死亡-配体1蛋白的表达还与结肠癌、子宫癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌等众多癌症的检测、诊断及预后评估相关(OhaegbulamKC,AssalA,Lazar-MolnarE,etal.HumancancerimmunotherapywithantibodiestothePD-1andPD-L1pathway.[J].TrendsinMolecularMedicine,2015,21(1):24-33.)。另外，LydieTrautmann等人研究发现，人细胞程序性死亡-配体1蛋白在HIV的诊断治疗方面也有一定作用(TrautmannL,JanbazianL,ChomontN,etal.UpregulationofPD-1expressiononHIV-specificCD8+Tcellsleadstoreversibleimmunedysfunction.[J].NatureMedicine,2006,12(10):1198-1202.)。因此，细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）是肿瘤相关检测及治疗的一个重要指标。目前国际上几大ELISA试剂盒生产商只是单一地生产人细胞程序性死亡-配体1蛋白蛋白或抗体，而尚未有生产整套人细胞程序性死亡-配体1蛋白ELISA试剂盒的报道，缺乏人细胞程序性死亡-配体1蛋白在人的血液、组织或细胞中定量的研究。本专利技术构建了一套用酶联免疫方法定量测定人样本中内源性人细胞程序性死亡-配体1蛋白的浓度。
技术实现思路
本专利技术的目的：提供一种新的用于人血清、或细胞培养上清中人细胞程序性死亡-配体1蛋白定量检测的ELISA试剂盒。本专利技术技术方案如下：1、抗人细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）特异性单抗包被反应板的制备，通过以下步骤：（1）28KD人细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）蛋白片段的获得：28KD细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）蛋白片段的原核表达：以BC074984DNA(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物，PCR扩增人细胞程序性死亡-配体1蛋白DNA片段（93nt-743nt），将所得片段克隆于载体pET28a（购自德国Merck公司），转化BL21（DE3）（购自Merck）感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明人细胞程序性死亡-配体1蛋白cDNA片段正确克隆至pET28a，为一个具有651bp的完整开放式阅读框，与GenBank中人源人细胞程序性死亡-配体1蛋白基因100%同源，推算其表达的蛋白质分子量为28KD，PI为6.4。①28KD人细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在28KD附近新增一条带，经Westernblotting鉴定，能与人细胞程序性死亡-配体1蛋白的抗体发生强阳性反应，说明该28KD的人细胞程序性死亡-配体1蛋白蛋白具有较强的免疫原性。②28KD的人细胞程序性死亡-配体1蛋白蛋白片段的制备与纯化：经大量培养、诱导、表达，使用Ni2+亲和层析柱（购自Pharmacia）纯化带有6×His标记的人细胞程序性死亡-配体1蛋白蛋白，得到大量28KD人细胞程序性死亡-配体1蛋白蛋白片段。（2）制备抗人细胞程序性死亡-配体1（PD-L1蛋白）的单抗：①人细胞程序性死亡-配体1蛋白蛋白的动物免疫：将28KD的人细胞程序性死亡-配体1蛋白蛋白片段与福氏佐剂混合并经充分乳化后，皮下注射，免疫鼠龄在8～12周的BALB/c健康小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）3至4只，每次免疫间隔为2周，直至血清效价高于4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人细胞程序性死亡‑配体1蛋白的单抗包被酶标板的制法，通过下列步骤制备而成：（1）以BC074984 DNA为模板，PCR扩增细胞程序性死亡‑配体1蛋白（PD‑L1）DNA片段（93nt‑743nt）基因片段，与载体PET28a连接，转化BL21，表达大量28 KD PD‑L1蛋白片段；（2）将28 KD 细胞程序性死亡‑配体1蛋白免疫小白鼠，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择阳性杂交瘤细胞于鼠腹水中培养，纯化蛋白得到抗人细胞程序性死亡‑配体1蛋白的单抗；（3）将所得单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释后包被96孔板，100μl/孔，4℃ 16‑24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后除尽孔内液体；（4）用含8% 小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗PD‑L1的单抗包被的酶标板，可用于PD‑L1的特异性检测。

【技术特征摘要】
1.人细胞程序性死亡-配体1蛋白的单抗包被酶标板的制法，通过下列步骤制备而成：（1）以BC074984DNA为模板，PCR扩增细胞程序性死亡-配体1蛋白（PD-L1）DNA片段（93nt-743nt）基因片段，与载体PET28a连接，转化BL21，表达大量28KDPD-L1蛋白片段；（2）将28KD细胞程序性死亡-配体1蛋白免疫小白鼠，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择阳性杂交瘤细胞于鼠腹水中培养，纯化蛋白得到抗人细胞程序性死亡-配体1蛋白的单抗；（3）将所得单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释后包被96孔板，100μl/孔，4℃16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后除尽孔内液体；（4）用含8%小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗PD-L1的单抗包被的酶标板，可用于PD-L1的特异性检测。2.应用权利要求1所述的人细胞程序性死亡-配体1蛋白的单抗包被酶标板的ELISA检测试剂盒，其特征为：由权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵以睿，王慕元，王鹏，邢田径，
申请(专利权)人：武汉三鹰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42