环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种环状RNA circ‑GPC3及其检测试剂与应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的环状RNA circ‑GPC3对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circ‑GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生；本发明专利技术环状RNA circ‑GPC3的检测引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；本发明专利技术环状RNA circ‑GPC3的检测探针如SEQ ID NO:4所示，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本发明专利技术提供了一种新的环状RNA分子—环状RNA circ‑GPC3，并以该环状RNA circ‑GPC3作为分子标志物诊断肝癌。本发明专利技术还设计针对环状RNA circ‑GPC3分子的荧光定量检测引物及taqman探针，该探针和引物能很好的检测生物体内的circ‑GPC3表达情况，可以为肝癌的诊断提供一种基于环状RNA检测的方案。

Cyclic RNA circ-GPC3 and its detection reagent and Application

The invention relates to a cyclic RNA circ_GPC3 and its detection reagent and application, belonging to the field of biotechnology. The cyclic RNA circ_GPC3 corresponding to the cDNA sequence of the invention is shown as SEQ ID NO:1. The cyclic RNA circ_GPC3 is produced by reverse splicing and cyclization of the third independent exon of the GPC3 mother gene; the detection primers of the cyclic RNA circ_GPC3 of the invention are shown as SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3; and the detection of the cyclic RNA circ_GPC3 of the invention is shown as SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3. The probe is shown as SEQ ID NO:4. The 5'end of the probe is labeled with fluorescent reporter group and the 3'end is labeled with fluorescent quenching group. The invention provides a novel circular RNA molecule, circular RNA circ_GPC3, and uses the circular RNA circ_GPC3 as a molecular marker to diagnose liver cancer. The invention also designs fluorescent quantitative detection primers and TaqMan probes for cyclic RNA circ_GPC3 molecules. The probes and primers can detect the expression of circ_GPC3 in vivo, and provide a scheme based on cyclic RNA detection for the diagnosis of hepatocellular carcinoma.

【技术实现步骤摘要】
环状RNAcirc-GPC3及其检测试剂与应用
本专利技术涉及一种环状RNAcirc-GPC3及其检测试剂与应用，具体涉及一种环状RNAcirc-GPC3、其检测引物和探针以及该环状RNAcirc-GPC3在肝癌诊断中的应用，属于生物

技术介绍
环状RNA(circRNA)是一类在生物体内存在的闭合的环状RNA分子，具有多种生物学特性，而且是客观大量存在的。环状RNA由基因组DNA转录加工后反向拼接产生的一类新颖的核酸分子。对于环化RNA的具体功能机制尚未明确，但在生物体内环状RNA可以多层次调控基因的表达，比如：环状RNA可以通过海绵作用吸附miRNA，转录后调控基因表达；环状RNA可以和RNA结合蛋白作用调控基因转录；环状RNA可以和基因组DNA结合调控RNA的剪接；另外环状RNA可以直接作为模板翻译蛋白质发挥重要的生物学作用。Glypican3(GPC3)是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白，全长蛋白位于细胞膜上。人的GPC3基因位于X染色体长臂26.2区域，全长基因组DNA跨越450151bp；最长转录RNA变异体包含9个外显子。GPC3的核酸及蛋白在肝、心、脑、脾、胃、小肠、大肠及胰腺等正常成人组织中均不表达或超微量表达，而在胎盘、胚胎肝、胚胎肺和胚胎肾中表达。1997年Hsu等报道GPC3mRNA在肝癌组织中特异性高表达，在非肿瘤性肝脏中不表达或极低表达。GPC3作为一种分泌型的糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白，在原发性肝癌患者的血清中可以被检测到，而在肝硬化、慢性肝炎以及正常人群的血清中则无法检测到，GPC3的存在并不受到AFP的影响，在AFP阴性或阳性的肝癌患者的血清中均能够检测到GPC3的存在。GPC3基因和肝癌的发生发展有密切关系，研究认为GPC3是肝癌发生过程中的一个早期事件，参与调控肝癌的发展过程；GPC3可以与Wnt通途信号分子形成复合物，通过自分泌和旁分泌的方式来增加经典Wnt途径中的信号分子的表达，促进肝癌细胞的生长。然而，现有技术暂无关于环状RNAcirc-GPC3的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种环状RNAcirc-GPC3及其检测试剂与应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种环状RNAcirc-GPC3，所述环状RNAcirc-GPC3对应的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述环状RNAcirc-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。本专利技术的环状RNAcirc-GPC3是申请人检索环状RNA数据库circbase及设计反向扩增PCR引物，经过大量研究，在肝癌细胞系Huh7中识别鉴定的一个新型的环状RNA分子。环状RNAcirc-GPC3是由GPC3基因的第3个独立完整的外显子首位相接连接而成的环状RNA分子，申请人将其命名为circ-GPC3，成熟circ-GPC3序列的长度为695nt。第二方面，本专利技术提供了上述环状RNAcirc-GPC3作为分子标志物在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。经过研究，申请人发现，本专利技术的环状RNAcirc-GPC3分子在肝癌细胞高表达，但在正常肝脏细胞中不表达，由此本专利技术的环状RNAcirc-GPC3可作为分子标志物用于诊断肝癌。并且，本专利技术环状RNAcirc-GPC3具有闭合的环状结构，不容易受核酸外切酶攻击，在生物体内非常稳定，是理想的分子诊断标志物。第三方面，本专利技术提供了上述环状RNAcirc-GPC3的检测试剂在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。第四方面，本专利技术提供了上述环状RNAcirc-GPC3的检测引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。该引物是用于扩增环状RNAcirc-GPC3对应的cDNA的反向PCR引物。第五方面，本专利技术提供了上述环状RNAcirc-GPC3的检测探针，所探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述探针是taqman探针，该探针能很好的检测生物体内的circ-GPC3表达情况，可以为肝癌的诊断提供一种基于环状RNA检测的方案。第六方面，本专利技术提供了上述引物和/或上述探针在制备用于检测环状RNAcirc-GPC3或诊断肝癌的试剂盒中的应用，所述环状RNAcirc-GPC3对应的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述环状RNAcirc-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。第七方面，本专利技术提供了用于检测环状RNAcirc-GPC3或诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和/或上述探针，所述环状RNAcirc-GPC3对应的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述环状RNAcirc-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和RCR反应液。作为本专利技术所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括去基因组DNA反应体系。作为本专利技术所述试剂盒的更优选实施方式，所述RNA提取试剂为Trizol试剂。本专利技术检测环状RNAcirc-GPC3或诊断肝癌的方法包括以下步骤：(1)提取肝脏细胞中的总RNA；(2)用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA；(3)将RNA逆转录成cDNA；(4)采用反向PCR引物和探针进行荧光定量PCR，检测环状RNAcirc-GPC3分子在肝脏细胞中的表达情况。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种新的环状RNA分子—环状RNAcirc-GPC3，并以该环状RNAcirc-GPC3作为分子标志物诊断肝癌。本专利技术还设计针对环状RNAcirc-GPC3分子的荧光定量检测引物及taqman探针，该探针和引物能很好的检测生物体内的circ-GPC3表达情况，可以为肝癌的诊断提供一种基于环状RNA检测的方案。附图说明图1为本专利技术环状RNAcirc-GPC3的分子定位及形成模式图；图2为本专利技术环状RNAcirc-GPC3的DNA测序验证环化接口峰图；图3为本专利技术Taqman探针荧光定量PCR检测环状RNAcirc-GPC3在正常肝脏细胞及肝癌细胞中表达的结果图。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术环状RNAcirc-GPC3的一种实施例，本实施例所述环状RNAcirc-GPC3对应的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述环状RNAcirc-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生，其成熟circ-GPC3序列的长度为695nt，环状RNAcirc-GPC3的分子定位及形成模式图如图1所示。实施例2本实施例设计PCR扩增引物并识别鉴定实施例1所述环状RNAcirc-GPC3在肝脏细胞中的客观存在。本实施例识别鉴定的方法包括以下步骤：1.Trizol方法提取肝脏细胞中的总RNA；2.用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA：3.将RNA逆转录成cDNA；4.设计反向扩增引物PCR扩增，PCR产物经核酸凝胶电泳后，割胶回收目标条带，然后经过sanger法DNA测序验证本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环状RNA circ‑GPC3，其特征在于，所述环状RNA circ‑GPC3对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circ‑GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。

【技术特征摘要】
1.一种环状RNAcirc-GPC3，其特征在于，所述环状RNAcirc-GPC3对应的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述环状RNAcirc-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。2.权利要求1所述环状RNAcirc-GPC3作为分子标志物在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。3.权利要求1所述环状RNAcirc-GPC3的检测试剂在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。4.权利要求1所述环状RNAcirc-GPC3的检测引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。5.权利要求1所述环状RNAcirc-GPC3的检测探针，其特征在于，所探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。6.权利要求4所述引物和/或权利要求5所述探针在制备用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂雷，赖炳权，罗景燕，赵发兰，
申请(专利权)人：广州永诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44