成软骨培养基及其在ADSCs成软骨分化中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种成软骨培养基及其在ADSCs成软骨分化中的应用。其包括以下成分，脂肪干细胞成软骨诱导分化基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF‑β3。利用一般培养基培养脂肪干细胞成软骨分化(Safranin 0染色)需要28天，且细胞实验检测发现，有部分细胞分化成了骨细胞(ALP染色鉴定)，而采用本发明专利技术培养基成软骨分化只需21天，同时抑制了ADSCs向成骨分化方向进行。

Chondrogenic medium and its application in chondrogenic differentiation of ADSCs

The invention provides a chondrogenic medium and its application in chondrogenic differentiation of ADSCs. It includes the following components: basic medium for cartilage induction and differentiation of adipose-derived stem cells, dexamethasone, ascorbic acid, ITS, sodium pyruvate, proline, TGF_beta 3. Chondrogenic differentiation (Safranin 0 staining) of adipose-derived stem cells (ADSCs) in general medium takes 28 days, and cell experiments show that some cells differentiate into osteoblasts (ALP staining identification), while chondrogenic differentiation only takes 21 days by using the present medium, and inhibits the direction of osteogenic differentiation of ADSCs.

【技术实现步骤摘要】
成软骨培养基及其在ADSCs成软骨分化中的应用
本专利技术涉及生物细胞学领域，尤其涉及成软骨培养基及其在在ADSCs成软骨分化中的应用。
技术介绍
膝关节软骨组织容易因创伤、感染、骨关节炎或其它疾病等造成损伤，而膝关节软骨可为膝关节之间的骨组织提供支撑和保护作用，因此一旦受损必将影响患者运动。由于软骨组织再生和自我修复能力有限，导致了软骨损伤修复仍然是临床上的一大难题和挑战。组织工程软骨的产生为软骨损伤临床治疗提供了美好的前景，但如何让种子细胞成功的快速的分化成软骨组织而不是成骨分化是组织工程中最大难题。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术一方面提供了一种成软骨培养基，其特征在于，包括以下成分，脂肪干细胞成软骨诱导分化基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3。本专利技术另一方面提供了上述的成软骨培养基在ADSCs成软骨分化中的应用，采用所述的成软骨培养基，在正常条件下诱导21天，每三天换一次液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：利用一般培养基培养脂肪干细胞成软骨分化(SafraninO染色)需要28天，且细胞实验检测发现，有部分细胞分化成了骨细胞(ALP染色鉴定)，而采用本专利技术培养基成软骨分化只需21天，同时抑制了ADSCs向成骨分化方向进行。附图说明：图1为本专利技术实施例中的脂肪干细胞分离及鉴定图。图2为本专利技术实施例中成骨与成软骨分化标记图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步地说明，以更好地理解本专利技术。1、脂肪干细胞分离：首先取新西兰大白兔腹股沟处的脂肪组织，放入含有青链霉素的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中洗净血污。转入一个新的培养皿中，充分剪碎，加入消化液(10％胎牛血清，0.09％胶原酶I，其余为DMEM/F12)，移液器充分打匀，直到组织可以通畅的出入吸嘴，将脂肪组织转入离心管中，37℃消化1h，定时摇晃，使组织和消化液充分混匀。消化完后，反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液。1200rpm离心5min，将上层的脂肪组织反复吹打最少1min，再次离心。弃掉上层成熟的脂肪组织和中层的消化液，再用基础培养基重悬底层的细胞。先将细胞悬液用250μM的尼龙滤网过滤细胞悬液，再将所得滤液用孔径为80μM的尼龙过滤，除去大部分的成熟脂肪细胞，收集滤液，每次过滤后注意再用适量的基础培养基洗涤滤网，减少滤网上的细胞残留。将最后得到的滤液离心，吸弃漂浮的脂肪细胞，用基础培养基反复洗涤3遍。细胞培养，最后一次用完全培养基重悬，接种，置于培养箱中常规培养。首次换液，弃去培养基，PBS反复洗涤5-6次，加入新鲜的完全培养基继续培养。重复3次换液直到细胞面基本干净。消化并扩大培养鉴定。利用常规免疫荧光方法及流式细胞仪技术检测ADSCs相对特异的分子CD29，CD44，CD90，CD105等。流式细胞仪技术检测细胞周期，计算处于G0/G1期的细胞比例。通过不同诱导液对体外培养的ADSCs进行诱导分化，使ADSCs向软骨细胞、脂肪细胞及内皮细胞方向分化，采用茜素红、ALP、油红、番红-O-染色及CD31等染色方法。2、成软骨分化：利用软骨分化诱导培养基(配方表1)，分TGF-β3添加组和非添加组，正常条件下诱导21天和28天，每3天换一次液。3、番红-O-染色(SafraninO)和碱性磷酸酶染色(ALP)样品经4％多聚甲醛溶液固定后，20％蔗糖脱水4-6h，30％蔗糖溶液脱水过夜，入O.T.C包埋剂浸泡2h，-20℃过夜，室温复温2h后再次入-20℃过夜，冰冻切片机切片8μm，37℃干燥过夜。0.02％fastgreen染色液染色4min，自来水漂洗，1％乙酸分色数秒钟，加入0.1％番红-O-染色液或ALP染色3min，自来水漂洗，干燥后中性树胶封片，移至显微镜下观察结果：1、脂肪干细胞的分离和鉴定：对ADsCs进行分离和鉴定结果如图1所示，对表面标记物进行免疫荧光检测发现ADSCs特异性标记蛋白CD29，CD44，CD90和CD105均有表达，而内皮细胞表面标记物vWF和CD34无表达，说明脂肪干细胞分离成功。2、研究发现如图2所示，ALP为成骨分化标记，SafraninO为成软骨分化标记，利用一般培养基培养脂肪干细胞成软骨分化(SafraninO染色)需要28天，且细胞实验检测发现，有部分细胞分化成了骨细胞(ALP染色鉴定)，而如果加入TGF-β3后成软骨分化只需21天，同时抑制了ADSCs向成骨分化方向进行。图2结果显示没有TGF-β3添加更容易向成骨方向分化，而加入了TGF-β3后明显促进了成软骨分化。表1为成软骨培养基配方：以上对本专利技术的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本专利技术并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本专利技术进行的等同修改和替代也都在本专利技术的范畴之中。因此，在不脱离本专利技术的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本专利技术的范围内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成软骨培养基，其特征在于，包括以下成分，脂肪干细胞成软骨诱导分化基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF‑β3。

【技术特征摘要】
1.一种成软骨培养基，其特征在于，包括以下成分，脂肪干细胞成软骨诱导分化基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3。...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐利民，严旭，王浩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四五五医院，
类型：发明
国别省市：上海,31