一种干细胞培养液及其制备方法技术

本发明专利技术属于细胞培养领域，具体公开了一种干细胞培养液的制备方法，本发明专利技术使用氨基聚糖(GAG)结构相仿的物质作为诱导剂，培养基、巯基乙醇和PH缓冲液能有效促进干细胞神经分化，提高分化率和促进干细胞往神经方向分化，为神经细胞的发育研究提供了一个较好的体外条件，为干细胞用于临床治疗神经系统疾病提供参考。

Stem cell culture medium and preparation method thereof

The invention belongs to the field of cell culture, and specifically discloses a preparation method of stem cell culture medium. The preparation method uses a substance with similar structure of aminoglycan (GAG) as an inducer. The culture medium, mercaptoethanol and PH buffer can effectively promote the neural differentiation of stem cells, improve the differentiation rate and promote the neural differentiation of stem cells. It provides a good condition for the development of neural cells in vitro and provides a reference for the clinical use of stem cells in the treatment of nervous system diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞培养液及其制备方法
本专利技术涉及细胞培养领域，具体地，涉及一种干细胞培养液的及其制备方法。
技术介绍
细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织(动物)。细胞培养技术作为一种培养细胞的技术方法在生物学领域已被深入广泛的应用于观察活细胞的形态结构和生命活动和细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。神经损伤已成为现代神经系统疾病的重要致病原因之一，传统的观点认为神经细胞具有难以再生，其伤害具有永久性，恢复难度大等特点，对相关的疾病治疗存在困难。随着近年的医学发展，有研究发现干细胞具有分化成为神经细胞的潜能，这为相关疾病治疗带来了福音。但现今对于诱导干细胞定向分化的研究和技术的研究还相对较少，这对于该类疾病的研究和治疗也存在限制。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种干细胞培养液及其制备方法，对于干细胞神经分化和定向神经分化有促进作用。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：氨基聚糖(GAG)是由重复二糖单位构成的无分枝长链多糖。其二糖单位通常由氨基已糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖)和糖醛酸组成可作为一种重要媒介用于调节干细胞生物行为，对于患有关节炎，风湿性关节炎患者有帮助，对骨头的愈合也有很大帮助。常见的硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(heparin)和透明质酸(HA)等。近年研究发现，氨基聚糖(GAG)是一种重要媒介用于调节干细胞生物行为。而诱导干细胞定向分化，如向神经方向分化，对于治疗神经损疾病有重要意义。仿生学是一门研究生物体的结构与功能工作的原理的科学，并模仿生物的特殊本领。本专利技术根据仿生学的原理以β-环糊精为基础合成出与氨基聚糖(GAG)结构相仿的物质用于促进干细胞神经分化。为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种干细胞培养液，含有培养基、巯基乙醇、PH缓冲液和诱导剂。优选地，所述的PH缓冲液为无菌磷酸盐缓冲液(PBS)。更优选地，所述的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)的PH值为：7.2～7.4。优选地，所述的培养基含有：DMEM/F2培养液，胎牛血清(FBS)，非必需氨基酸，青霉素和谷氨酰胺。更优选地，所述的胎牛血清(FBS)的终浓度为10％。更优选地，所述的谷氨酰胺的终浓度为2.2mM。更优选地，所述的青霉素的终浓度为100U/ml。更优选地，所述的非必需氨基酸的浓度为0.1mM。优选地，所述的诱导剂为氨基聚糖(GAG)结构相仿的物质。更优选地，所述的氨基聚糖(GAG)结构相仿的物质的浓度为0.9μg/ml。更优选地，所述的氨基聚糖(GAG)结构相仿的物质为一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精中的一种或其混合物。以上所述的干细胞培养液在干细胞神经分化和定向神经分化中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种促进干细胞分化的方法。该专利技术利用前面所述的干细胞培养液，培养所述干细胞。专利技术人惊奇的发现，采用该方法培养干细胞，显示该培养液与干细胞有良好的兼容性，有利于细胞活性的保持，与肝素相比，干细胞的神经分化能力更强，干细胞往神经方向分化率更高。本专利技术提供了一种用于干细胞培养，并能够促进干细胞向神经方向的培养液。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种干细胞培养液。根据本专利技术的实施例，该细胞培养液培养的细胞种类不受特别限制，只要培养液能用于培养细胞即可。根据本专利技术的实施例，该培养液含有DMEM/F2培养液，胎牛血清(FBS)，非必需氨基酸，青霉素、谷氨酰胺、巯基乙醇、PH缓冲液和诱导剂。专利技术人惊奇的发现，采用该方法培养干细胞，显示该培养液与干细胞有良好的兼容性，有利于细胞活性的保持，与肝素相比，干细胞的神经分化能力更强，干细胞往神经方向分化率更高。实施例1：本实施例中，采用分别添加诱导剂一取代的磺化β-CD、二取代的磺化β-CD以及一取代的磺化β-CD和二取代的磺化β-CD混合物的的细胞培养液3种；与分别添加β-CD的细胞培养液和添加肝素的细胞培养液以及不添加其它物质的细胞培养液3种作为对照，对体外诱导扩增的干细胞进行培养，以便观察诱导剂对干细胞培养的影响。具体如下：1、采用不含诱导剂的细胞培养液培养干细胞1.1细胞的复苏和培养(1)细胞复苏将胚胎成纤维细胞的细胞悬浮滴加到温度为35℃添加了100U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基(以下称为改良的1640培养基)中进行混合，随后离心取沉淀，并往里加入培养液吹打，使其形成悬浮液，并将其移到新培养瓶中，同时将培养瓶放置在温度35℃的培养箱5％CO2浓度环境中，并往瓶中加入5ml改良的1640培养基和0.6ml的胎牛血清溶液进行培养，需每隔2天换一次培养液。(2)细胞传代细胞生长覆盖瓶底达到80％以上时，可进行细胞传代。首先，倒掉旧培养液，其次再用无菌磷酸盐缓冲液冲洗细胞；随后，倒掉无菌磷酸盐缓冲液，之后，再往加入1ml0.3％蛋白酶溶液，直至细胞溶解；之后，再往里加入3ml改良的1640培养基，并吹打细胞使其分散，离心取沉淀，再加入新的培养液，并将其移到新培养瓶中，同时将培养瓶放置在温度35℃的培养箱5％CO2浓度环境中，并往瓶中加入5ml改良的1640培养基和0.6ml的胎牛血清溶液进行培养，需每隔2天换一次培养液。(3)制备胚胎成纤维细胞滋养层先用丝裂霉素C(1g/ml)对滋养层细胞进行处理，待其传代至第四代时，往培养瓶中加入低浓度的(10μg/ml)丝裂霉素C，将该溶液在35℃中培养3小时。随后，吸出培养液，再用10ml丝裂霉素C对其进行处理，并用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)对其进行清洗。再往培养瓶中加入1ml0.3％蛋白酶，至细胞脱壁。再加入3～5ml改良的1640培养基，离心取沉淀，再加入新的改良的1640培养基进行培养。(4)干细胞复苏和培养在干细胞培养前，至少需要提前两天将培养瓶瓶底用明胶溶液包被，明胶溶液包被1天后再将滋养层细胞培养在培养瓶底部，具体操作如下；往培养瓶中加入2ml0.1％明胶包被溶液，置于细胞培养箱一天，弃掉培养瓶中液体后再对成纤维细胞滋养层细胞进行复苏，用改良的1640培养基培养一天以上，铺有滋养层的培养瓶需要在5天内使用。随后，将铺有滋养层细胞的培养瓶中的液体弃掉，再将干细胞复苏到培养瓶中，采用1640培养基培养，每天换液一次，每3天传代一次。传代细胞均培养在铺有成纤维细胞滋养层细胞的培养瓶。(5)β-CD和肝素对干细胞增殖的影响先将干细胞与成纤维细胞滋养层细胞分离。然后，采用干细胞培养基对分离后的干细胞进行培养，并在培养基中分别加入0.9μg/ml的β-环糊精和肝素。β-CD和肝素样品事先均用少量无菌磷酸盐缓冲液(PBS)配制为50μg/ml的母液，并在添加到干细胞培养基前用无菌滤器过滤除菌。细胞每天换液一次。在干细胞分别培养1天、3天及5天后，通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)实验测试其增殖效率。进行细胞分化培养之前，先除去成纤维细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞培养液，其特征在于，所述的干细胞培养液含有培养基、巯基乙醇、PH缓冲液和诱导剂。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞培养液，其特征在于，所述的干细胞培养液含有培养基、巯基乙醇、PH缓冲液和诱导剂。2.根据权利要求1所述的干细胞培养液，其特征在于，所述的PH缓冲液为无菌磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的干细胞培养液，其特征在于，所述的干细胞为胚胎干细胞或间充质干细胞中的一种。4.根据权利要求2所述的干细胞培养液，其特征在于，所述的无菌磷酸盐缓冲液的PH值为：7.2～7.4。5.根据权利要求1所述的干细胞培养液，其特征在于，所述的培养基含有：DMEM/F2培养液，胎牛血清(FBS)，非必需氨基酸，青霉素和谷氨酰胺。6.根据权利要求1所述的干细胞培养液，其特征在于，所述的诱导剂为氨基聚糖结构相仿的物质：一取代的磺化β-环糊精或二取代的磺化β-环糊精中的一种或其混合物。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦玥，
申请(专利权)人：深圳市益鑫智能科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44