橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途，所述启动子WY51具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的变体。本发明专利技术还涉及含有所述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、转基因植物、外植体和愈伤组织。所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。

The endogenous promoter WY51 of powdery mildew of rubber tree and its use

The present invention discloses a kind of rubber tree powdery mildew endogenous promoter WY51 and its use, the promoter WY51 has a nucleotide sequence shown by SEQ ID NO:1, or a variant of its promoter function. The invention also relates to a nucleic acid construct, a carrier, a recombinant cell, a transgenic plant, an explant and a callus containing the promoter. The promoter can be used to regulate the expression of exogenous target genes in dicotyledonous plants and monocotyledon plants, and provide a new tool and choice for gene expression of transgenic plants.

【技术实现步骤摘要】
橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途
本专利技术属于基因工程
，具体涉及橡胶树白粉菌内源启动子WY51及其用途。
技术介绍
启动子是起始基因转录的一段能够被RNA聚合酶所识别、结合并有效起始下游序列转录的DNA序列，是基因表达调控的关键点。根据启动子调控模式特点大致可分为组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子这三类。在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。组成型启动子的表达不受外界环境的调控且无组织特异性，几乎在所有器官和组织中都有表达，且表达一般具有持续性，不表现时空特异性。目前转基因工程中使用的启动子多数都是组成型的，在双子叶植物的转基因工程中被广泛应用的是烟草花叶病毒的CaMV35S启动子。CaMV35S启动子具有多个顺式作用元件，其转录起始位点上游343-46bp处是转录增强区，上游343-208bp处和208-90bp处是转录激活区，90-46bp处是转录活性进一步增强区。在了解CaMV35S启动子各种顺式作用元件的基础上，人们就可以利用它的核心序列构建人工启动子使之转录活性进一步增强或进一步寻找表达强度更强的启动子来替代CaMV35S启动子。另外，玉米泛素基因Ubi-1启动子和水稻肌动蛋白基因Actin1启动子也属于组成型启动子，有研究表明这些启动子在单子叶植物大麦和玉米中的表达效率是CaMV35S的几十甚至上百倍，而在双子叶植物中仅有微弱的表达。由于组成型启动子具有持续性、稳定性和高效性等优点，可通过过表达来研究目的基因功能或者获取某一表达的产物，最大限度地实现人们的研究目的。组成型启动子可使目的基因高效而持续地表达，但外源基因的有效表达常常导致大量的植物能量和营养成分的消耗，并且不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，影响植物的生长和发育。此外，如果重复采用同一类型启动子驱动两个或以上外源基因则有可能引发基因沉默。因此，为了控制植物中外源基因表达的时间和精度，并减少对植物生长、发育和代谢途径的影响，采用诱导型或组织特异型启动子代替组成型启动子可以更灵活的调控目的基因的表达。现有的研究结果表明，真菌内源启动子在表达内源基因时通常表达量惊人，而在表达外源基因时往往表达量大大降低。橡胶树白粉菌是一种专性寄生真菌，其遗传转化体系尚未建立，找到一种强效内源启动子，加强后期工作中其在橡胶树白粉菌中调控内源基因表达的相关研究，对于建立橡胶树白粉菌遗传转化体系也是不无裨益的。
技术实现思路
针对以上现有技术的不足之处，本专利技术提供一种橡胶树白粉菌内源启动子WY51。本专利技术采取的技术方案如下：一种橡胶树白粉菌内源启动子WY51，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；b、与SEQIDNO：1互补的核苷酸序列；c、能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。优选的，所述启动子的制备方法包括：以橡胶树白粉菌基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQIDNO：1在橡胶树白粉菌基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。进一步的，本专利技术还涉及一种核酸构建体，其包含本专利技术的启动子，与启动子可操作连接的基因序列。进一步的，本专利技术还涉及一种重组载体，所述载体为本专利技术的启动子与pGEM-Teasy或PBI121质粒经重组所得。进一步的，本专利技术还涉及一种重组细胞，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求3的核酸构建体或权利要求4的重组载体。优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌农杆菌细胞。进一步的，本专利技术还涉及一组引物对，所述引物对的两条引物分别含有SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的序列；所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。进一步的，本专利技术还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本专利技术的启动子或核酸构建体或重组载体或感染本专利技术的重组细胞。进一步的，本专利技术还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本专利技术的启动子或核酸构建体或重组载体或感染有本专利技术的重组细胞。进一步的，本专利技术还涉及所述启动子WY51或所述核酸构建体或所述重组载体或所述重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：提供了一种来源于橡胶树白粉菌的新的启动子WY51，所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。附图说明图1为重组载体PBI121-WY51的质粒图谱。图2为启动子WY51重组载体PBI121-WY51的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘的GUS染色结果。图中，WY51为PBI121-WY51转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK+(CaMV35S)为由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK-(无菌苗)为未转化的三生烟无菌苗叶盘的GUS染色结果。图3为WY51转基因三生烟各生长时期图；图中，由左至右依次为共培养期、愈伤期、侧芽期、生根期、成株期。图4为WY51调控GUS基因转基因三生烟的PCR扩增检测结果。图中，M:Marker2000；WY51：WY51调控GUS基因转基因三生烟叶片DNA；CK+：转PBI121空载体的转基因三生烟；CK-:野生型三生烟。图5为启动子WY51重组载体PBI121-WY51的重组根癌农杆菌介导转化的水稻(日本晴)愈伤的GUS染色结果；图中，WY51为PBI121-WY51转化水稻愈伤叶盘的GUS染色结果；CK+(CaMV35S)为由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体转化水稻愈伤的GUS染色结果；CK-为未转化的日本晴水稻愈伤的GUS染色结果。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。实施例一、WY51启动子片段的PCR扩增使用真菌基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，D3390-01)提取橡胶树白粉菌(海南省热带生物资源可持续利用重点实验室提供)的基因组DNA，根据WY51启动子的序列，设计一对特异性扩增引物(上游引物WY51F，加限制性酶切位点HindⅢ和保护碱基，下游引物WY51R，加限制性酶切位点BamHⅠ和保护碱基)。以上述提取的橡胶树白粉菌的基因组DNA为模板，使用高保真ExTaq聚合酶(TRANSGEN，AP122)进行PCR扩增。如表1所示。表1基因启动子扩增的PCR体系PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性60s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸5min。上游引物WY51F：CCCAAGCTTATTGGTATTCGAGTACATGG，其中下划线代表HindⅢ酶切位点。下游引物WY51R：CGGGATCCTGTTTCTGACTCACTTGCAAA，其中下划线代表BamHⅠ酶切位点。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为260bp左右的条带，使用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.橡胶树白粉菌内源启动子WY51，其特征在于，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；c、能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.橡胶树白粉菌内源启动子WY51，其特征在于，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；b、与SEQIDNO：1互补的核苷酸序列；c、能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子的制备方法包括：以橡胶树白粉菌基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQIDNO：1在橡胶树白粉菌基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。3.一种核酸构建体，其特征在于，其包含权利要求1所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列。4.一种重组载体，其特征在于，所述载体为权利要求1所述的启动子与pGEM-Teasy或PBI121质粒经重组所得。5.一种重组细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪卫国，王义，刘文波，郑服丛，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46