一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法，包括以下步骤：获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。本发明专利技术还提供了该平滑肌细胞的鉴定方法。本发明专利技术对食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法简单、完善而有效，鉴定方法可以鉴定出平滑肌细胞特有的表型。

A method of primary culture and identification of smooth muscle cells in the esophagogastric junction

The present invention relates to a method for the primary culture and identification of smooth muscle cells of the esophagogastric junction, including the following steps: obtaining the smooth muscle tissue of the esophagogastric junction, digesting the muscle strips of the smooth muscle tissue with the digestive juice, and obtaining the smooth muscle tissue after digestion; the smooth muscle tissue after digestion is used. The blocks were transferred to the culture container to fix the digested smooth muscle tissue blocks at the bottom of the culture vessel, and the distance between the adjacent smooth muscle tissue blocks was 0.5 ~ 1cm, and the cells were cultured over 90% or between the adjacent smooth muscle tissue blocks from the bottom of the culture vessel and through the new cells. Contact. The invention also provides a method for identifying the smooth muscle cell. The method is simple, perfect and effective for the primary culture of smooth muscle cells of the esophagogastric junction. The identification method can identify the specific phenotype of smooth muscle cells.

【技术实现步骤摘要】
一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法
本专利技术关于细胞培养
，尤其涉及一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法。
技术介绍
原发性食管运动功能障碍性疾病(PEMD)包括贲门失弛缓症(EAC)、弥漫性食管痉挛(DES)、胡桃钳食管(NE)、食管下括约肌高压症(HLES)等，均发生于食管中下段至食管胃结合部(EGJ)，均以病变段食管高压型蠕动异常、食管对食团的推动力减弱或消失为动力学特点，临床表现均为慢性间歇性胸痛和吞咽困难。由于其临床表现与食管动力有直接关系，因此食管胃结合部平滑肌组织舒缩相关调控机制在PEMD病因学和病理生理学方面的研究非常重要，有必要探索人源性消化道平滑肌细胞在体外培养过程中的生长规律、表型转换特点并开拓相应生理功能的研究以更好的了解消化道平滑肌细胞的生理机制，为消化道运动功能障碍和消化道再造的研究做铺垫。目前有学者对食管平滑肌细胞组织块法原代培养方法进行了相关研究，但实验步骤繁琐，并且缺乏对所涉及的结缔组织细胞的详细鉴定。
技术实现思路
针对现有技术中实验步骤繁琐、对所涉及的结缔组织细胞缺乏详细鉴定的技术问题，本专利技术提供了一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法。以及，一种对上述食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法所得平滑肌细胞的鉴定方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，包括以下步骤：步骤a、获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；步骤b、将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；步骤c、将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。以及，本专利技术实施例还提供了一种对上述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法所得平滑肌细胞的鉴定方法，以α-SMA、Vimentin、Desmin、CD90、SM22α和PCNA蛋白作为标志物。相对于现有技术而言，本专利技术对食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法简单、完善而有效，鉴定方法可以鉴定出平滑肌细胞特有的表型。按本专利技术所提供的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养及鉴定方法为原发性食管运动功能障碍性疾病和食管组织工程学研究奠定了基础，所得平滑肌细胞还可以应用于组织工程、再生医学研究，以便将来制作人体替代组织。附图说明图1为EI-T组平滑肌细胞组织块法原代培养过程中细胞生长示图；图2为T组平滑肌细胞组织块法原代培养过程中细胞生长示图；图3为TD-T组平滑肌细胞组织块法原代培养过程中细胞生长示图；图4为3组平滑肌新生细胞爬出时间比较；图5为3组平滑肌组织块贴壁至初次分瓶中位时间比较；图6为3组平滑肌已爬出新生细胞的组织块占全部贴壁组织块的中位比例比较；图7为平滑肌细胞传代培养后各组细胞形态；图8为平滑肌细胞群体生长形态；图9为平滑肌细胞结节状隆起；图10为第3代平滑肌细胞在SMCS及10％-F12两种培养基中增殖情况；图11为食管胃结合部6种平滑肌组织标志性蛋白免疫组织化学染色示例；图12为食管胃结合部6种平滑肌组织标志性蛋白mRNA表达的扩增曲线和溶解曲线；图13为食管胃结合部6种平滑肌组织标志性蛋白mRNA表达量；图14为平滑肌细胞的荧光鉴定；图15为平滑肌细胞的标志蛋白表达；图16为平滑肌细胞的标志蛋白表达荧光数据。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，包括以下步骤：步骤a、获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；步骤b、将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；步骤c、将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。相对于现有技术而言，本专利技术对食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法简单、完善而有效，所得平滑肌细胞还可以应用于组织工程、再生医学研究，以便将来制作人体替代组织。具体的，上述步骤a具体包括以下操作：取手术中切除的食管胃结合部组织，翻转至黏膜面，以碘伏擦洗所述黏膜面，锐性分离黏膜层，剪除表面薄层透明结缔组织，剪取平滑肌组织，制备平滑肌组织肌条，迅速置于盛有培养基与抗生素的容器中，即得。进一步优选地，所述取手术中切除的食管胃结合部组织，其近端供血血管离断不超过40min，组织离体不超过15min，以确保组织保存生存活性，在后续操作时间内保持细胞活力；所述平滑肌组织肌条的平面尺寸为5～15mm×5～10mm，该尺寸有利于平滑肌条的剪取、保存并保证后续实验的基本组织需求量；所述培养基为DMEM/F-12，作为开发无血清配方的基础，具有F12含有较丰富的成分以及DMEM含有较高浓度营养的综合优点；所述抗生素为青链霉素，属于广谱抗生素，可用于预防细胞培养的细菌污染，特别是革兰氏阳性和阴性细菌的污染；整个操作过程在10min内完成，以避免因离体时间过长而影响平滑肌条的活性。上述步骤b中所述消化酶包括胰酶/EDTA、胶原酶Ⅰ、胶原酶II、胶原酶Ⅴ、胶原酶Ⅷ、胶原酶Ⅺ、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、中性蛋白酶/分散酶、大豆胰蛋白酶抑制剂，上述消化酶均可用于平滑肌细胞的消化，可以给研究人员在获取平滑肌细胞时提供更多选择。进一步优选地，所述消化酶为胶原酶II，所述胶原酶II的浓度为125～200CDU/mg，所述胶原酶II在所述消化液中的浓度为0.5～1.0mg/ml，胶原酶Ⅱ对细胞间质有消化作用，可水解结缔组织中胶原蛋白成分，利于细胞从组织块中迁出，使细胞初次分瓶时间明显缩短，所述消化酶还包括0.25％胰蛋白酶/EDTA，是适合本专利技术中平滑肌细胞培养的试剂，可通过降解细胞间蛋白从而使细胞分开，消化酶浓度太高会损伤平滑肌细胞膜，从而影响平滑肌细胞活性，不利于细胞的贴壁和增殖。进一步优选地，所述步骤b具体包括以下操作：将步骤a所得平滑肌组织肌条剪成平面尺寸为5～8mm×5mm的组织块，以增加组织块与消化液的接触面积，有利于消化的进行，且组织块更容易贴服于容器底部；以PBS和抗生素混合液，再以PBS漂洗，以去除残余培养基、组织渗出物等；以DMEM/F-12原液溶解消化酶配制成消化液，将所述组织块置于装有所述消化液的容器中，吸取部分所述消化液注入所述组织块内使所述组织块充盈饱满；置于4℃环境中进行消化14～24h，消化时间太短则消化效果较差，消化时间太长则会由于消化酶损伤细胞膜而影响平滑肌细胞活性，不利于其贴壁和增殖；消化终止时加入新生牛血清；以尖端抛光、开口较大的吸管吹打，可使组织块与单个细胞分离；过滤，得到消化后的平滑肌组织块；经过酶消化处理的组织块更易爬出新生细胞，且细胞初次分瓶时间短本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；步骤b、将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；步骤c、将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。

【技术特征摘要】
1.一种食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、获取食管胃结合部的平滑肌组织肌条；步骤b、将所述平滑肌组织肌条用消化液消化，得到消化后的平滑肌组织块；步骤c、将所述消化后的平滑肌组织块转移至培养容器中使所述消化后的平滑肌组织块固定于培养容器底部，且相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间的间距为0.5～1cm，培养至贴壁细胞占培养容器底部90％以上或相邻的所述消化后的平滑肌组织块之间通过新生细胞接触。2.根据权利要求1所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述步骤b中所述消化酶包括胰酶/EDTA、胶原酶Ⅰ、胶原酶II、胶原酶Ⅴ、胶原酶Ⅷ、胶原酶Ⅺ、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、中性蛋白酶/分散酶、大豆胰蛋白酶抑制剂。3.根据权利要求2所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述消化酶为胶原酶II或胰蛋白酶/EDTA，其中，所述胶原酶II的浓度为125～200CDU/mg，所述胶原酶II在所述消化液中的浓度为0.5～1.0mg/ml，所述胰蛋白酶/EDTA的浓度为0.25wt％。4.根据权利要求1所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述步骤b具体包括以下操作：将步骤a所得平滑肌组织肌条剪成平面尺寸为5～8mm×5mm的组织块；以PBS和抗生素的混合液漂洗，再以PBS漂洗；以DMEM/F-12原液溶解消化酶配制成消化液，将所述组织块置于装有所述消化液的容器中，吸取部分所述消化液注入所述组织块内使所述组织块充盈饱满；置于4℃环境中进行消化14～24h后，加入新生牛血清，以尖端抛光、开口较大的吸管吹打；过滤，得到消化后的平滑肌组织块。5.根据权利要求4所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法，其特征在于：所述抗生素为青链霉素；所述混合液中PBS与抗生素的体积比为5:1；所述以PBS与抗生素混合液漂洗为漂洗2次，每次漂洗时间为3min；所述以PBS漂洗为漂洗1次，漂洗时间3min；所述装有所述消化液的容器中消化液的体积为组织块体积的5～6倍；所述消化的过程中间断轻柔震动；所述新生牛血清的体积为所述消化液体积的20％～25％；所述吹打时间为5min；所述过滤的滤网为尼龙网，孔径为200μm。6.根据权利要求1所述的食管胃结合部平滑肌细胞的组织块法原代培养方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：高杨，刘俊峰，赵连梅，张胜雷，
申请(专利权)人：河北医科大学第四医院，
类型：发明
国别省市：河北,13