HPLC指纹图谱的构建方法及HPLC指纹图谱技术

本发明专利技术三七药物分析领域，具体涉及三七药材和三七总皂苷的HPLC指纹图谱的构建方法及HPLC指纹图谱包括如下步骤：(1)分别称取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rf对照品，加甲醇溶解，制成浓度为30‑70μg·mL‑1的混合对照品溶液；(2)称取三七样品，置于容器中，加入甲醇配置为浓度为30‑50mg/mL的溶液，称重，超声提取30‑60min，冷却至室温，用甲醇补充损失的溶剂，提取液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；(3)分别取步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液做高效液相色谱分析；(4)利用对照品对照法，采用LC‑MS或HPLC‑MS指证指纹图谱中的化学成份，建立三七药材HPLC指纹图谱。本发明专利技术可以用于三七药材及总皂苷提取物的质量分析以及提供依据。

【技术实现步骤摘要】
HPLC指纹图谱的构建方法及HPLC指纹图谱
本专利技术三七药物分析领域，具体涉及三七药材和三七总皂苷的HPLC指纹图谱的构建方法及HPLC指纹图谱。
技术介绍
三七为五加科Araliaceae人参属Panax植物三七Panaxnotoginsng(Burk)F.H.Chen。始载于《本草纲目》，主产于我国云南、广西等省，功能散瘀止血、消肿定痛，为临床常用中药。三七的主要有效成分为三七总皂苷，具有扩张血管，降低心肌耗氧量，抑制血小板凝集，延长凝血时间，降血脂，清除自由基，抗炎，抗氧化等药理作用，其中含量较高并有市售标准品的有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rd、Rc和Rf等。目前，商品三七的规格品种多样，质量不一。05版药典规定三七为其原植物的根和根茎，其中主根为临床所用三七，支根习称筋条，根茎习称剪口。三七总皂苷提取物生产厂家常用三七剪口或筋条为原料，民间也有使用三七叶和花。而不同的三七药用部位及其提取物的主要皂苷类成分的含量差别明显。CN201710569313.2公开了一种对三七及其伪品的快速鉴别方法，具体步骤为，收集三七及其伪品若干，将样品粉碎，过120目筛，分别放入密封的塑料瓶中；采集样品的近红外光谱；分别优化系统聚类分析最佳类内聚类和类间距离，偏最小二乘判别分析的因子数，极限学习机激励函数和隐含层节点数；考察系统聚类分析、偏最小二乘判别分析和极限学习机三种化学模式识别方法的鉴别效果，选取最佳的化学模式识别方法。CN201710569315.1公开了一种利用紫外可见光谱及化学模式识别对三七及其伪品进行鉴别的方法，具体步骤为：收集一定数目的三七及其伪品，干燥，粉碎，过120目筛，存贮在密封的塑料瓶中；确定紫外可见光谱仪器的测试参数，采集样品的紫外可见光谱；对每类中药分别用KS法划分，2/3的样品用作训练，1/3的样品用作预测，将所有类别的训练数据合并为总的训练集，预测数据合并为总的预测集；确定PLS-DA因子数，建立PLS-DA模型，将预测集样品的光谱代入到PLS-DA模型中，得到预测集中样品的类别。上述两片文献分别从红外分析和紫外分析的方法进行鉴别，且只作为真伪的鉴别，无法很好地辨别三七的药用部位。HPLC，即高效液相色谱检测方向具有高效、高灵敏度等特点。因此，建立一种三七不同药用部位及其提取物中主要成分的HPLC指纹图谱分析方法，比较不同药用部位和不同规格三七及其提取物的差异具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供三七药材和三七总皂苷的HPLC指纹图谱的构建方法及HPLC指纹图谱。本专利技术所采取的技术方案如下：三七药材HPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：(1)分别称取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rf对照品，加甲醇溶解，制成浓度为30-70μg·mL-1的混合对照品溶液；(2)称取三七样品，置于容器中，加入甲醇配置为浓度为30-50mg/mL的溶液，称重，超声提取30-60min，冷却至室温，用甲醇补充损失的溶剂，提取液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；(3)分别取步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液做高效液相色谱分析；(4)利用对照品对照法，采用LC-MS或HPLC-MS指证指纹图谱中的化学成份，建立三七药材HPLC指纹图谱。其中高效液相色谱分析的条件设置如下：色谱柱为KromasilC18色谱柱，250×4.6mm，5μm，流动相为乙腈和水，流速为1mL·min-1；柱温为30℃；检测波长：203nm；进样量：20μL。其中高效液相色谱分析中流动相采取梯度洗脱，具体比例如下设置：乙腈：0-5min5-20％；5-20min20-36％；20-45min36-80％；45-50min80-100％；50-60min100％；60-70min100-5％；水：0-5min95→80％；5-20min80→64％；20-45min64→20％；45-50min20→0％；50-60min0％；60-70min0-95％。三七HPLC指纹图谱测定方法经过方法学考察，5次实验各特征峰的相对峰面积和相对保留时间的精密度和稳定性RSD均小于4.24％；9次实验的相对峰面积测试重现性RSD小于6.47％。通过上述的三七药材HPLC指纹图谱的构建方法所构建的三七药材HPLC指纹图谱，所述三七药材为三七主根、筋条、剪口、叶和花，其中所有三七样品的共有峰有10种，三七主根、筋条、剪口的共有峰有13种，叶和花的特征峰有1种。三七皂苷R1为参照峰，三七样品的10种共有峰及其相对保留时间如下：1号峰0.257～0.258min；4号峰14.338～14.364min；5号峰1.078～1.080min；7号峰1.594～1.604min；8号峰1.649～1.655min；9号峰1.719～1.723min；11号峰1.820～1.823min；14号峰3.567～3.633min；15号峰3.769～3.776min；17号峰4.427～4.437min。三七地下部分主根、筋条、剪口的除三七样品的10种共有峰以外的3种共有峰及其相对保留时间如下：2号峰0.404～0.407min；10号峰0.751～0.752min；13号峰3.13～3.217min。三七叶和花的特征峰及其相对保留时间如下：3号峰0.658～0.659min。三七总皂苷HPLC指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：(1)分别称取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rf对照品，加甲醇溶解，制成浓度为30-70μg·mL-1的混合对照品溶液；(2)称取三七总皂苷，加甲醇超声溶解，配制成2mg/mL的溶液，即得供试品溶液；(3)分别取步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液做高效液相色谱分析；(4)利用对照品对照法，采用LC-MS或HPLC-MS指证指纹图谱中的化学成份，建立三七药材HPLC指纹图谱。通过上述的三七药材HPLC指纹图谱的构建方法所构建的三七总皂苷HPLC指纹图谱，三七总皂苷HPLC指纹图谱具有6种皂苷类成分特征峰，分别为三七皂苷R1、人参皂苷Re和Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd。本专利技术的有益效果如下：本专利技术建立三七及其总皂苷提取物的HPLC指纹图谱分析方法，精密度、稳定性和重现性良好，完全能满足三七HPLC指纹图谱测定要求。并对不同药用部位和不同规格三七及其总皂苷提取物进行指纹图谱分析，比较其相同点和不同点，可以为三七药材及总皂苷提取物的质量分析提供依据。附图说明图1为三七对照药材的HPLC/UV指纹图谱。图2为三七对照药材的HPLC/MS总离子流图(负离子模式)。图3为不同规格三七主根的HPLC指纹图谱(S1-S5分别为20、40、60、80、100头三七)。图4.三七不同药用部位的HPLC指纹图谱(S1-S5分别是三七筋条、剪口、20头、叶、花)。图5.三七总皂苷HPLC指纹图谱(S1-S7分别是三七根、筋条和剪口自提、宁波中药厂、昆明圣火、云南红云、西安国圣)。图6.三七HPLC/MS提取离子流图(EIC)。具体实施方式实施例一：1.色谱条件色谱柱：KromasilC1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.三七药材HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)分别称取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rf对照品，加甲醇溶解，制成浓度为30‑70μg·mL‑1的混合对照品溶液；(2)称取三七样品，置于容器中，加入甲醇配置为浓度为30‑50mg/mL的溶液，称重，超声提取30‑60min，冷却至室温，用甲醇补充损失的溶剂，提取液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；(3)分别取步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液做高效液相色谱分析；(4)利用对照品对照法，采用LC‑MS或HPLC‑MS指证指纹图谱中的化学成份，建立三七药材HPLC指纹图谱。

【技术特征摘要】
1.三七药材HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)分别称取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rf对照品，加甲醇溶解，制成浓度为30-70μg·mL-1的混合对照品溶液；(2)称取三七样品，置于容器中，加入甲醇配置为浓度为30-50mg/mL的溶液，称重，超声提取30-60min，冷却至室温，用甲醇补充损失的溶剂，提取液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；(3)分别取步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液做高效液相色谱分析；(4)利用对照品对照法，采用LC-MS或HPLC-MS指证指纹图谱中的化学成份，建立三七药材HPLC指纹图谱。2.根据权利要求1所述的三七药材HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：其中高效液相色谱分析的条件设置如下：色谱柱为KromasilC18色谱柱，250×4.6mm，5μm，流动相为乙腈和水，流速为1mL·min-1；柱温为30℃；检测波长：203nm；进样量：20μL。3.根据权利要求2所述的三七药材HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：其中高效液相色谱分析中流动相采取梯度洗脱，具体比例如下设置：乙腈：0-5min5-20％；5-20min20-36％；20-45min36-80％；45-50min80-100％；50-60min100％；60-70min100-5％；水：0-5min95→80％；5-20min80→64％；20-45min64→20％；45-50min20→0％；50-60min0％；60-70min0-95％。4.根据权利要求3所述的三七药材HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：三七HPLC指纹图谱测定方法经过方法学考察，5次实验各特征峰的相对峰面积和相对保留时间的精密度和稳定性RSD均小于4.24％；9次实验的相对峰面积测试重现性RSD小于6.47％。5.通过权利要求1-4任一项所述的三七药材HPLC指纹图谱的构建方法所构建的三七药材HPLC指纹图谱，其特征在于：所述三七药材为三七主根、筋条、剪口、叶和花，...

【专利技术属性】
技术研发人员：怀化，
申请(专利权)人：亳州中药材商品交易中心有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34