检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物技术

本发明专利技术公开了检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物，包括A组引物对和B组引物对，所述方法为：1）以待检细胞培养物上清液作为第一轮PCR模板，以Hela细胞纯培养的上清液作为PCR阳性对照，用A组引物对进行第一轮PCR；2）以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用B组引物对进行第二轮PCR；3）琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。本发明专利技术耗时短、成本低，灵敏度高，传统的STR鉴定法灵敏度低，在作为污染源的细胞数量低于总细胞数量的10%时，STR无法检测到细胞污染，而本发明专利技术灵敏度提高到了1%，是STR的10倍。本发明专利技术无需提取核酸，无需破坏细胞，可以直接检测，是“无损无创”的检测方法。

Methods and primers for detecting cell cross contamination induced by Hela cells

The present invention discloses the method and primers for detecting cross contamination of cells caused by Hela cells, including primer pairs in group A and primer pairs in group B, the method is: 1) the supernatant of cell culture substance is used as the first round PCR template, the pure culture supernatant is used as the PCR positive control, and the first round PCR is carried out with the A group primers. 2) 2) the first round PCR product was used as the second wheel PCR template, and the B group primers were used for second rounds of PCR; 3) agarose gel electrophoresis to detect the second round PCR products and determine whether the cells to be examined were contaminated by Hela cells. The invention has short time, low cost, high sensitivity, low sensitivity of the traditional STR identification method. When the number of cells as the source of pollution is lower than 10% of the total cell number, STR can not detect cell pollution, and the sensitivity of the invention is increased to 1%, which is 10 times that of STR. The invention does not need to extract nucleic acids, does not need to destroy cells, and can be directly detected. It is a \non-invasive, non-invasive\ detection method.

【技术实现步骤摘要】
检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物
本专利技术属于生物
，具体涉及检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的引物及方法。
技术介绍
Hela细胞是细胞生物学和医学、药学研究中的常用细胞，其增殖异常迅速，亦是细胞交叉污染的重要来源之一。目前已经被证明污染并完全取代了许多其他细胞系。HeLa细胞株是一种具有无限增殖能力的细胞系，其来源于1952年一位美国黑人妇女的宫颈癌组织。作为第一个被确定能够在体外培养的人宫颈癌细胞系，HeLa细胞广泛应用于宫颈癌的研究，并且在宫颈癌细胞生物学研究和宫颈癌的诊治中发挥着重要作用。此外，HeLa细胞还作为细胞生物学的研究模型，广泛地应用于基础生物学研究。HeLa细胞不同于其他细胞系的特征之一就是其增殖异常迅速，此外，Hela细胞非常容易养活，它可以很容易适应不同的培养基和生长条件，如DMEM、MEM、RMPI1640、DMEM/F12K培养基等等。因此，HeLa细胞是细胞交叉污染的重要污染源之一。从1969年到2004年，PubMed数据库中的220篇出版物被发现使用了HeLa污染的细胞系。根据ATCC最新统计显示，ATCC细胞库中已有116个细胞系被HeLa细胞污染并完全取代。使用错误和污染的细胞系进行研究实验，将导致研究结果错误，进而造成巨大的经济损失和社会损失。例如，在药学研究中，如果原先计划开发针对肺癌的药物，但是细胞实验时，肺癌细胞被Hela细胞(宫颈癌)污染了，得到的实验结果是无效的，必然造成研究经费的浪费，如果没有发现污染，而直接将研究结果用于临床人体试验，那么后果十分可怕。目前检测细胞交叉污染的方法很多，STR分析法(AnalysisofShorttandemrepeatsequence)是较常用的一种检测方法。STR是串联重复的DNA短序列，在人类基因组中是高度多态的，通常长度为2-6bp。STR分析时，先要提取细胞样品基因组，随后用带有荧光基团标记的引物进行PCR，每一个STR位点均能被扩增且扩增产物标记上不同颜色的荧光。通过毛细管电泳分离后得到不同大小的片段，将片段大小转换为等位基因(Allele)峰图，通过峰图与参考数据库中的图谱进行比对后即能分析是否存在细胞交叉污染。通过STR分析，可以鉴定出发生交叉污染的人类细胞系。但是，STR分析需要大型仪器，过程相对复杂，其耗时长，成本高，精度低。尤为重要的一点是，根据文献(MastersJR,ThomsonJA,Daly-BurnsBetal.(2001)Shorttandemrepeatprofilingprovidesaninternationalreferencestandardforhumancelllines.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica98,8012-8017.)报道，在作为污染源的细胞数量低于总细胞数量的10％时，STR无法检测到细胞污染。人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)是一种小的、无包膜的双链DNA病毒，归属于乳头瘤病毒科。1984年BoshartM等人在HeLa细胞中检测到HPV18基因的存在。作为HPV18阳性人宫颈癌细胞系，HeLa细胞中存在两个HPV18基因，长度分别为7.8kb和6.9kb。而绝大部分人类细胞系不含HPV18病毒。目前尚未有任何报道提出将HPV病毒作为生物标记物，来检测Hela细胞造成的人类细胞系交叉污染。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种无需损坏细胞直接快速检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的引物，包括A组引物对和B组引物对，所述A组引物对的序列如下：A组上游引物：5’GGTGCCAGAAACCGTTGAATC3’；A组下游引物：5’CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA3’；所述B组引物对的序列如下：B组上游引物：5’CAACCGAGCACGACAGGAA3’；B组下游引物：5’ATTGCTCGTGACATAGAAGG3’。基于本专利技术提供的引物检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法，包括以下步骤：1)以待检细胞培养物上清液作为第一轮PCR模板，以Hela细胞纯培养的上清液作为PCR阳性对照，用A组引物对进行第一轮PCR；2)以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用B组引物对进行第二轮PCR；3)琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。所述第一轮PCR的反应体系为：2XTaqMasterMix(CWBiotech,CW0682,China)12.5μL，上清液模板5μL，A组上游引物1μM，A组下游引物1μM，补水到25μL；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸2min。所述第二轮PCR的反应体系为：2XTaqMasterMix(CWBiotech,CW0682,China)12.5μL，第一轮PCR产物0.5μL，B组上游引物1μM，B组下游引物1μM，补水到25μL；反应条件如为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30，72℃延伸15s，35个循环，72℃终延伸2min。本专利技术采用以上技术方案，通过检测HPV18基因序列，将其作为生物标记物，从而间接探测HeLa细胞是否存在，以判断目标细胞系是否被Hela细胞污染。本专利技术具有以下有益效果：1、传统的STR鉴定法灵敏度低，在作为污染源的细胞数量低于总细胞数量的10％时，STR无法检测到细胞污染，而本专利技术灵敏度提高到了1％，是STR的10倍。2、传统的STR鉴定方法和传统的HPV病毒鉴定，都需要破坏细胞，从中提取出核酸，本专利技术无需提取核酸，无需破坏细胞，可以直接检测，是“无损无创”的检测方法。3、本专利技术只要用最简单和廉价的琼脂糖凝胶电泳，无需使用昂贵的荧光染料，无需使用荧光PCR、毛细管电泳仪、激光扫描等昂贵大型设备，耗时短、成本低。附图说明图1为实施例1的琼脂糖凝胶电泳图；图2为实施例1的PCR扩增产物测序结果；图3为实施例2的STR鉴定图谱。具体实施方式以下的实施例便于更好的理解本专利技术，但并不限定本专利技术。序列说明：SEQIDNO.1-4分别是A组上游引物、A组下游引物、B组上游引物、B组下游引物。实施例1PCR引物的设计、筛选、对比实验及验证从NCBI的Genbank数据库获取Humanpapillomavirus-18序列(GeneBankID:NC_001357)，根据分子生物学的PCR引物设计原理，通过生物信息学计算筛选得到了7条评分较高的PCR上游引物序列，和7条评分较高的下游引物序列，如表1所示。人工合成引物，将这些上游引物和下游引物进行随机配对，之后用PCR实验和琼脂糖凝胶电泳，筛选能够实现本专利技术目的的引物对。筛选原则是：排除掉无法扩增得到PCR产物的引物对，排除有非特异性扩增的引物对，得到能够高效且特异性扩增得到目的HPV序列的引物对。表1上游引物下游引物5'CCATAGTGAAACACAAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的引物，其特征在于：其包括A组引物对和B组引物对，所述A组引物对的序列如下：A组上游引物：5’GGTGCCAGAAACCGTTGAATC 3’；A组下游引物：5’CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA 3’；所述B组引物对的序列如下：B组上游引物：5’CAACCGAGCACGACAGGAA 3’；B组下游引物：5’ATTGCTCGTGACATAGAAGG 3’。

【技术特征摘要】
1.检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的引物，其特征在于：其包括A组引物对和B组引物对，所述A组引物对的序列如下：A组上游引物：5’GGTGCCAGAAACCGTTGAATC3’；A组下游引物：5’CGTCGGGCTGGTAAATGTTGA3’；所述B组引物对的序列如下：B组上游引物：5’CAACCGAGCACGACAGGAA3’；B组下游引物：5’ATTGCTCGTGACATAGAAGG3’。2.基于权利要求1所述的引物检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法，其特征在于：1)以待检细胞培养物上清液作为第一轮PCR模板，以Hela细胞纯培养的上清液作为PCR阳性对照，用A组引物对进行第一轮PCR；2)以第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用B组引物对进行第二轮PCR；3)琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，判断待检细胞是否被Hela细胞污染。3.根据权利要求2所述的检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：林峻，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35