极端逆转录PCR制造技术

提供用于实施RT‑PCR的方法、试剂盒和混合物，其中RT温育不超过1分钟和PCR循环为每个循环

Extreme reverse transcriptase PCR

A method, kit and mixture for implementing RT PCR are provided, wherein the incubation of RT does not exceed 1 minutes and the PCR cycle is each cycle.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】极端逆转录PCR优先权声明本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年11月5日提交的美国临时申请序列号62/251400的权益，其整个内容本文通过参照结合。专利技术背景聚合酶链式反应(PCR)为一种在分子生物学中广泛使用的技术。其名字源自其一种关键组分，即DNA聚合酶，该酶用于通过体外酶促复制扩增DNA片段。随着PCR进行，所产生的DNA(扩增子)本身被用作复制的模板。这启动DNA模板指数扩增的链式反应。通过PCR，有可能将DNA片段的单个或几个拷贝扩增跨越几个数量级，产生DNA片段的数百万或更多个拷贝。PCR采用热稳定聚合酶、dNTP和引物对。PCR在概念上分成3个反应，每个反应通常假定在3种温度中的每一种下随着时间的推移而发生。PCR的这种“平衡范式”易于理解为在每个循环的3个时间段于3种温度下发生的3个反应(变性、退火和延伸)。然而，这种平衡范式并不完全符合物理现实。瞬间温度改变不会发生，改变样品温度需要时间。此外，单个反应速率随着温度而变化，并且一旦发生引物退火，聚合酶延伸紧随其后。更准确地，特别是对于快速PCR，为一种其中反应速率和温度总是在改变的动力学范式。只要产物变性和引物退火，保持温度在PCR期间恒定是不必要的。在PCR的动力学范式下，产物变性、引物退火和聚合酶延伸可能在时间上重叠，并且其速率随着温度连续变化。在平衡范式下，循环通过每种保持一段时间的3种温度来定义，而动力学范式则需要转换速率和靶标温度。平衡和动力学范式的说明性时间/温度概况显示在图15a-15b中。然而，应该理解，这些温度概况仅为说明性的，并且在PCR的一些实施中，将退火和延伸步骤组合，使得仅需要2种温度。范式没有对或错，只是其用处各不相同。平衡范式简单易懂，并且非常适合于工程思维和仪器制造。动力学范式与生物化学、快速循环PCR和解链曲线分析更相关。当PCR在20世纪80年代后期首次普及时，过程缓慢。一个典型方案为94℃下变性1分钟，55℃下退火2分钟和72℃下延伸3分钟。当包括温度之间的转换时间时，典型的是8分钟循环，导致在4小时内完成30个循环。25%的循环时间耗费在温度转换。随着循环速度增加，耗费在温度转换的时间比例也增加，并且动力学范式变得越来越相关。在快速循环PCR期间，温度通常会改变。对于短产物(<100bp)的快速循环PCR，100%的时间可能耗费在温度转换，并且没有保持时间是必要的。对于较长产物的快速循环PCR，可包括在最佳延伸温度下保持的温度。孤立地说，术语“快速PCR”既相对又模糊。1小时PCR比4小时快，但是比15分钟慢。此外，如果以较高模板浓度起始或使用较少循环，则可使PCR方案较短。更具体的量度为每个循环所需的时间。因此，1994年将“快速循环PCR”(或“快速循环”)定义为在10-30分钟内完成30个循环(1)，导致每个循环20-60秒。每个循环的这种实际时间超过对于变性、退火和延伸通常的编程化时间总和，因为需要时间来渐变这些阶段中每个之间的温度。20世纪90年代早期的初始工作确立了使用毛细管和热空气进行温度控制的快速循环的可行性。这些年来，系统变得更快速，并且变性、退火和延伸的动力学需要变得更清晰。在一种早期快速系统中，来自吹风机的加热元件和风扇、热电偶和毛细管中的PCR样品被封闭在室中(2)。风扇创建加热空气通过热电偶和毛细管的快速流动。通过匹配热电偶对样品的热响应，即使在温度改变期间，热电偶的温度也密切跟踪样品温度。尽管空气的热导率低，但是快速移动的空气相对于毛细管所暴露的大表面积足以使样品在变性、退火和延伸温度之间循环。电子控制器监测温度，调节加热元件的功率，并且提供需要的定时和循环数目。为了进行冷却，控制器启动电磁铁，后者打开通向外部空气的入口，将冷却空气引入到本来密闭的室。温度可使用毛细管/空气系统快速改变。使用低蓄热室、循环空气和玻璃毛细管中的样品，在PCR仅10分钟(30个循环，每个20秒)后，在溴化乙锭染色的凝胶上可见>500bp的PCR产物(3)。产物产率受延伸时间和聚合酶浓度的影响。用30秒循环时间(在70-80℃之间约10秒用于延伸)，带强度随着聚合酶浓度从每10μl反应物0.1增加至0.8单位而增加。注意到聚合酶单位的定义可能会令人困惑。对于天然Taq聚合酶，在典型快速循环条件下，0.4U/10μl为约1.5nM(50)。快速方案使用瞬间或“0”秒保持在变性和退火温度下。也就是说，温度-时间概况显示变性和退火的温度尖峰，而没有保持顶部和底部温度。变性和退火可以很快速发生。温度的快速和准确控制允许分析研究PCR所需的温度和时间。对于人基因组DNA(β-球蛋白)的说明性536bp片段，变性温度在91℃-97℃之间同样有效，变性时间从<1秒到16秒也是如此。然而，发现变性时间超过16秒实际上减少产物产率。只要用于引物退火的时间有限，退火温度为50-60℃即可以良好产率获得特异性产物。也就是说，通过从变性到退火的快速冷却和退火时间<1秒获得最佳特异性。在延伸温度为75-79℃并且延伸时间增加至多达约40秒时，产率最佳。这项早期工作的结论为：1)PCR产物的变性非常快速，不需要保持变性温度，2)引物的退火可以很快速发生并且退火温度保持可能不必要，和3)所需的延伸时间取决于PCR产物长度和聚合酶浓度。同样，快速循环PCR不仅更快速，而且就特异性和产率而言更好(4,5)，只要精确控制温度。PCR速度不受可用生物化学的限制，但是受到不能密切或快速控制样品温度的仪器限制。然而，当前大部分实验室PCR仪器在瞬间变性和退火时间方面表现不佳，并且许多甚至使得不能编程“0”秒保持时间。通过锥形管壁传热的时间延迟、表面积-体积比率低和大样品的加热迫使大部分仪器依赖于延长变性和退火时间，以确保样品达到期望的温度。由于这些时间延迟，精确的温度与时间过程的关系变得不确定。结果是商业产品之间的重现性有限以及高度变化性(6)。许多仪器在温度转换期间显示显著的温度变化(7,8)。温度的下冲和/或过冲为一个长期问题，很少通过取决于样品体积的尝试性软件预测来解决。这种困难由于与可能随着年限而改变的仪器的热性能而加剧。随着时间的推移，常规热块(heatblock)仪器已经由于“薄壁”管的逐步改善、样品之间更导热性分布、低蓄热块及其他“快速”改良而变得更快速。尽管如此，这些系统充分快速循环以在不到60秒内完成一个循环也是少见的。一些热块系统可实现<60秒循环，通常限于在有限的温度范围之间进行2温度循环。通过使样品容器变平，快速循环可通过电阻加热和空气冷却(9)，或者通过在保持在恒定温度下的加热区之间的柔性管中移动样品(美国专利第6706617号)来实现。商业版本的用于PCR的空气/毛细管系统自1991年以来已可用(1)，并且自1996年以来已用于实时PCR(10,11)。其他仪器的快速循环能力通常与首次证实20-60秒循环的空气/毛细管标准相比。说来也怪，这些年来一直趋于较慢运行毛细管/空气系统，或许反映许多用户对“0”秒变性和退火时间的不适。同样，热激活酶需要长的激活时间，甚至在使用“快速”激活酶时其运行时间通常会加倍本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在扩增期间扩增生物样品中的靶标RNA的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含所述生物样品、逆转录酶、热稳定聚合酶和配置用于扩增所述生物样品中的所述靶标RNA的引物的反应混合物，其中所述聚合酶以至少0.5 μM的浓度提供，且引物各自以至少2 μM的浓度提供；通过温育不超过5分钟的逆转录时间将所述RNA逆转录成DNA，和使用极端温度循环概况，通过在至少变性温度与延伸温度之间热循环所述生物样品通过多个扩增循环，经聚合酶链式反应扩增所述DNA，其中每个循环在每个循环少于20秒的循环时间内完成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.05 US 62/2514001.一种用于在扩增期间扩增生物样品中的靶标RNA的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含所述生物样品、逆转录酶、热稳定聚合酶和配置用于扩增所述生物样品中的所述靶标RNA的引物的反应混合物，其中所述聚合酶以至少0.5μM的浓度提供，且引物各自以至少2μM的浓度提供；通过温育不超过5分钟的逆转录时间将所述RNA逆转录成DNA，和使用极端温度循环概况，通过在至少变性温度与延伸温度之间热循环所述生物样品通过多个扩增循环，经聚合酶链式反应扩增所述DNA，其中每个循环在每个循环少于20秒的循环时间内完成。2.权利要求1的方法，其中所述逆转录时间不超过1分钟。3.权利要求2的方法，其中所述逆转录时间不超过16秒。4.权利要求2的方法，其中所述逆转录时间不超过8秒。5.权利要求2的方法，其中所述逆转录时间不超过4秒。6.权利要求2的方法，其中所述逆转录时间不超过2秒。7.权利要求1-6中任何一项的方法，其中还向所述生物样品中加入糖。8.权利要求7的方法，其中所述糖为至少0.2M海藻糖。9.权利要求1-8中任何一项的方法，其中所述逆转录步骤在54℃-62℃之间的温度下发生。10.权利要求9的方法，其中所述逆转录步骤在56℃的温度下发生。11.权利要求1的方法，其中所述引物各自以至少4μM的浓度提供。12.权利要求1的方法，其中所述引物各自以至少6μM的浓度提供。13.权利要求1的方法，其中所述扩增步骤在与所述逆转录步骤相同的反应混合物中发生。14.权利要求1的方法，其中所述反应混合物具有不超过10mM的KCl浓度。15.权利要求1的方法，其中所述反应混合物基本上不含钾。16.权利要求1的方法，其中所述反应混合物进一步包含还原剂。17.权利要求1的方法，其中所述逆转录酶为以约1.0-约50U/μl提供的MMLV。18.权利要求1的方法，其中所述转录酶为以不超过4.0单位/μL的浓度提供的MMLV。19.权利要求1的方法，其中所述逆转录酶为以约0.1-约10U/μl提供的AMV。20.权利要求1的方法，其中所述逆转录酶为以不超过0.8单位/μL的浓度提供的AMV。21.权利要求1的方法，其中所述扩增步骤具有等于所述循环时间乘以循环数目的扩增时间，所述方法具有等于所述逆转录时间和所述扩增时间总和的总体时间，和所述逆转录时间不超过所述总体时间的50%。22.权利要求21的方法，其中所述逆转录时间不超过所述总体时间的20%。23.权利要求21的方法，其中所述逆转录时间不超过所述总体时间的10%。24.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：CT维特维尔，JF夸肯布什，JA豪斯基珀，
申请(专利权)人：犹他州大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国,US