一种用于富集纯化c-kit制造技术

本发明专利技术公开了一种用于富集纯化c‑kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法，属于生物材料领域，本发明专利技术复合涂层包含有亲水聚合物A、亲水聚合物B和水，亲水聚合物A为藻酸盐或聚氧丙烯和聚氧乙烯构成的聚醚，亲水聚合物B为明胶、纤连蛋白或多聚赖氨酸。本发明专利技术复合涂层制备方法简单，复合涂层能简化c‑kit+心脏干细胞的分离方法，且富集纯化的c‑kit+心脏干细胞聚集体能良好地治疗缺血损伤心肌疾病。

One kind is used to enrich and purify c-kit

The invention discloses a composite coating for the enrichment and purification of C kit+ heart stem cell and its preparation method, which belongs to the field of biological materials. The composite coating contains hydrophilic polymer A, hydrophilic polymer B and water, hydrophilic polymer A is a polyether composed of alginate or polyoxypropylene and polyoxyethylene, and hydrophilic polymer B is a kind of polyether. Gelatin, fibronectin or polylysine. The preparation method of the composite coating is simple. The composite coating can simplify the separation of C kit+ heart stem cells, and the concentration and purification of C kit+ cardiac stem cell aggregates can treat the ischemic injury of myocardial disease well.

【技术实现步骤摘要】
一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法
本专利技术属于生物材料领域，尤其涉及一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法。
技术介绍
缺血性心肌病造成的心肌受损是目前心脏疾病中死亡率最高的疾病之一，而细胞再生疗法被认为是最有潜力的治疗方法之一。诱导心肌干细胞的增殖分化，或者刺激其分泌生长因子被认为具有保护和修复受损心肌组织。研究表明，心脏中c-kit+干细胞具有保护和修复受损心肌的潜能。目前，c-kit+心脏干细胞的分离和纯化方法主要是免疫磁珠筛选法，这种方法是利用细胞表面抗原c-kit与对应的筛选磁珠相结合而对细胞进行筛选。由于筛选出来的细胞为分散状态且携带有分选的磁珠，其在心肌受损治疗中存在缺陷：用量大、黏附能力弱、活性低，大幅度降低了干细胞再生疗法的治疗效果。因此，有必要简化c-kit+心脏干细胞的分离方法，且使富集纯化的c-kit+心脏干细胞能良好地治疗心肌受损。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法，该复合涂层制备方法简单，复合涂层能简化c-kit+心脏干细胞的分离方法，且富集纯化的c-kit+心脏干细胞能良好地治疗受损心肌。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层，其包含有亲水聚合物A、亲水聚合物B和水，所述亲水聚合物A为藻酸盐或聚氧丙烯和聚氧乙烯构成的聚醚，所述亲水聚合物B为明胶、纤连蛋白或多聚赖氨酸。本专利技术所述新型涂层复合物，通过改变复合涂层中所用到的组成物(含高亲水基团的亲水聚合物A和含中等亲水基团的亲水聚合物B)的比例，在不需要借助任何抗体情况下，能简单高效地将c-kit+心脏干细胞聚分离出来，且为c-kit+心脏干细胞集体，是目前的分离纯化方法所不具备的：现有的方法仅仅是分离出单个分散的c-kit+心脏干细胞，这些c-kit+心脏干细胞的黏附能力弱、活性低。作为上述技术方案的改进，所述聚醚至少为泊洛沙姆F68和泊洛沙姆F127中的一种。作为上述技术方案的进一步改进，所述亲水聚合物A为泊洛沙姆F68，所述亲水聚合物B为明胶。另外，本专利技术还提供所述的复合涂层的制备方法，其包括以下步骤：s1)溶解：将亲水聚合物A溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物A溶解液；将亲水聚合物B溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物B溶解液；s2)混合：将亲水聚合物A溶解液与亲水聚合物B溶解液混合、搅拌，即得复合涂层溶解液；s3)灭菌和孵育：对所述复合涂层溶解液进行过滤，过滤后的复合涂层溶解液加入到细胞培养容器的表面，并置于培养箱中进行孵育；s4)干燥：将孵育后的复合涂层溶解液置于无菌环境中，吸弃培养容器中剩余的水溶液，并进行干燥，即可用于富集纯化c-kit+心脏干细胞。作为上述技术方案的改进，在所述亲水聚合物A溶解于水过程中，亲水聚合物A与水的质量比为0.1％～10％。作为上述技术方案的改进，在所述亲水聚合物B溶解于水过程中，亲水聚合物B与水的质量比为0.1％～10％。作为上述技术方案的改进，在步骤s2)混合中，所述亲水聚合物A溶解液和所述亲水聚合物B溶解液的质量比为0.1％～99.9％。作为上述技术方案的改进，所述步骤s1)溶解的温度为60℃；所述步骤s3)孵育的温度为37℃，时间为18h；所述步骤s4)干燥的时间至少为2h。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法，本专利技术所述新型涂层复合物，通过改变复合涂层中所用到的组成物(含高亲水基团的亲水聚合物A和含中等亲水基团的亲水聚合物B)的比例，在不需要借助任何抗体情况下，能简单高效地将c-kit+心脏干细胞分离出来，富集纯化的c-kit+心脏干细胞聚集体能良好地治疗受损心肌；另外，本专利技术复合涂层制作过程简单，所需时间短，造价便宜，易于控制和实施，且产品收率高。附图说明图1A显示心脏细胞悬浮液在刚加入包被有复合涂层的培养板表面时细胞状态；图1B显示心脏细胞在包被有复合涂层的培养板表面上培养24h后细胞状态；图2A显示利用复合涂层培养分离后形成的细胞聚集体(Agg)中c-kit的表达情况；图2B显示利用复合涂层培养分离后形成的分散黏附在复合涂层表面的细胞(Att)中c-kit的表达情况；图2C统计所有细胞聚集体和所有单个分散细胞中表达c-kit的干细胞比率；图3是显示免疫荧光染色对分离形成的细胞聚集体和单个分散细胞群中的细胞进行染色；其中，从上到下，依次为明视野图，标记c-kit的图，标记TnI(肌细胞的标记蛋白)的图，标记c-kit和TnI融合的图；另外，右侧图中白色圆圈标出的是细胞聚集体而不是单个分散细胞；图4A显示传代一次培养(P1)的心脏细胞在复合涂层上的状态；图4B显示传代二次培养(P2)的心脏细胞在复合涂层上的状态；图4C显示传代五次培养(P5)的心脏细胞在复合涂层上的状态；图4D显示心脏细胞传代一次、二次和五次培养后，经复合涂层富集纯化所得细胞聚集体中c-kit+心脏干细胞的比率(％)；图5显示心脏细胞缺血处理后，在不同处理下的细胞LDH蛋白释出量；其中，空白对照组(Con)：心脏细胞在无任何处理的对照培养120h；阴性对照组(IS)：心脏细胞在缺血损伤后无任何后处理培养120h；试验组(Agg)：心脏细胞在缺血损伤后立刻加入富集纯化的c-kit+心脏干细胞聚集体，共同培养120h；注：图中星号表示与空白对照组存在显著性差异：p＜0.05；图6显示心脏细胞在缺血损伤后，加入的c-kit+心脏干细胞聚集体与心脏细胞的状态；图7显示心脏细胞缺血处理后，在不同处理下的细胞LDH蛋白释出量；其中，空白对照组(Con)：心脏细胞在无任何处理的对照培养120h；阴性对照组1(IS)：心脏细胞在缺血损伤后无任何后处理培养120h；阴性对照组2(Non-treat)：心脏细胞在缺血损伤后加入无任何细胞因子的培养液培养120h；试验组(AggCM)：心脏细胞在缺血损伤后立刻加入c-kit+心脏干细胞聚集体分泌的合成培养液，共同培养120h；注：图中星号表示与空白对照组存在显著性差异：p＜0.05。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步说明。实施例1本实施例提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层的制备方法，其包括以下步骤：s1)溶解：将泊洛沙姆F68溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物A溶解液；将明胶溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物B溶解液；溶解时的温度为60℃；泊洛沙姆F68溶解于水过程中，泊洛沙姆F68与水的质量比为0.1％；明胶溶解于水过程中，明胶与水的质量比为6％；s2)混合：将亲水聚合物A溶解液与亲水聚合物B溶解液混合、搅拌，即得复合涂层溶解液；所述亲水聚合物A溶解液和所述亲水聚合物B溶解液的质量比为0.1％；s3)灭菌和孵育：采用孔径为7μm过滤器对复合涂层溶解液进行过滤，过滤后的复合涂层溶解液加入到细胞培养容器的表面，并置于培养箱中进行孵育；孵育时的温度为37℃，时间为18h；s4)干燥：将孵育后的复合涂层溶解液连同细胞培养容器置于超净工作台中，吸弃细胞培养容本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于富集纯化c‑kit+心脏干细胞的复合涂层，其特征在于，包含有亲水聚合物A、亲水聚合物B和水，所述亲水聚合物A为藻酸盐或聚氧丙烯和聚氧乙烯构成的聚醚，所述亲水聚合物B为明胶、纤连蛋白或多聚赖氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层，其特征在于，包含有亲水聚合物A、亲水聚合物B和水，所述亲水聚合物A为藻酸盐或聚氧丙烯和聚氧乙烯构成的聚醚，所述亲水聚合物B为明胶、纤连蛋白或多聚赖氨酸。2.如权利要求1所述的复合涂层，其特征在于，所述聚醚至少为泊洛沙姆F68和泊洛沙姆F127中的一种。3.如权利要求1或2所述的复合涂层，其特征在于，所述亲水聚合物A为泊洛沙姆F68，所述亲水聚合物B为明胶。4.一种如权利要求1～3任一项所述的复合涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1)溶解：将亲水聚合物A溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物A溶解液；将亲水聚合物B溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物B溶解液；s2)混合：将亲水聚合物A溶解液与亲水聚合物B溶解液混合、搅拌，即得复合涂层溶解液；s3)灭菌和孵育：对所述复合涂层溶解液进行过...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鲲，杨膺，黄舒婷，谢博文，王奕翔，汤恺，刘昊，
申请(专利权)人：广州大学，
类型：发明
国别省市：广东,44