核糖核蛋白转染剂制造技术

本文提供了尤其适用于将核糖核蛋白复合物(例如Cas9/向导RNA复合物)递送到细胞中的组合物和方法。本文提供的所述组合物和方法特别适用于将核糖核蛋白复合物递送到多能细胞和淋巴细胞中。

Ribonucleoprotein transfection agent

This article provides a combination and method especially suitable for delivering ribonucleoprotein complexes (e.g. Cas9/GNA complexes) to cells. The compositions and methods provided herein are particularly suitable for delivering ribonucleoprotein complexes to pluripotent cells and lymphocytes.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核糖核蛋白转染剂交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年10月14日提交的美国临时申请第62/241,559号的优先权，其与本申请共同拥有，并且其在此通过引用整体明确地并入，如同在本文中完全阐述一样。序列表本申请在此通过引用并入与本文同时提交的电子序列表的材料。电子序列表中的材料以ASCII格式以电子方式提交，并且在此通过引用整体并入。2016年10月14日产生的所述ASCII副本名称为LT01100_SL.txt并且大小为22,543字节。
技术介绍
CRISPR技术的最新进展使研究人员能够在体内有效地工程改造细胞和回路。然而，Cas9核酸酶的潜在脱靶效应仍然是治疗应用的主要关注点。最近，由于高编辑效率和降低的脱靶效应，纯化的Cas9蛋白和gRNA复合物(Cas9RNP)的递送已经引起越来越多的关注。尽管Cas9RNP可以通过电穿孔递送到哺乳动物细胞中，但是脂质介导的转染在递送Cas9RNP方面效率低，所述转染由于易用性、低成本和适应高通量系统而是优选的递送方法。特别是多能干细胞和淋巴来源的细胞已经对使用脂质介导方法的CAS9RNP转染有抗性。因此，本领域需要能够将核酸、蛋白质和/或核糖核蛋白递送到这些细胞中的转染组合物和方法。本文提供的专利技术解决了本领域中的这些缺点和其他缺点。
技术实现思路
第一方面，提供了一种包括核糖核蛋白复合物、形成脂质聚集体的阳离子脂质和增强子元件的组合物。另一方面，提供了一种形成细胞转染组合物的方法。所述方法包括以下步骤：(i)使核糖核酸、内切核酸酶以及增强子元件接触，从而形成核糖核蛋白-增强子元件复合物；和(ii)使形成脂质聚集体的阳离子脂质与核糖核蛋白-增强子元件复合物接触，从而形成细胞转染组合物。另一方面，提供了一种形成细胞转染组合物的方法。所述方法包括以下步骤：(i)使形成脂质聚集体的阳离子脂质与细胞培养基在第一反应容器中接触，从而形成形成脂质聚集体的阳离子脂质培养基；(ii)使核糖核酸、内切核酸酶以及增强子元件在第二反应容器中接触，从而形成核糖核蛋白-增强子元件复合物；和(iii)使形成脂质聚集体的阳离子脂质培养基与核糖核蛋白-增强子元件复合物在第二反应容器中接触，从而形成细胞转染组合物。另一方面，提供了一种形成细胞转染组合物的方法。所述方法包括以下步骤：(i)使核糖核酸、内切核酸酶以及增强子元件在第一反应容器中接触，从而形成核糖核蛋白-增强子元件复合物；(ii)使形成脂质聚集体的阳离子脂质与细胞培养基在第二反应容器中接触，从而形成形成脂质聚集体的阳离子脂质培养基；和(iii)使核糖核蛋白-增强子元件复合物与形成脂质聚集体的阳离子脂质培养基在第二反应容器中接触，从而形成细胞转染组合物。另一方面，提供了一种包括真核细胞、核糖核蛋白复合物、形成脂质聚集体的阳离子脂质以及增强子元件的体外细胞培养物。另一方面，提供了一种将核糖核蛋白复合物转染到细胞中的方法。所述方法包括使细胞与本文提供的组合物(包括其实施例)接触。附图说明图1A至1D.识别CRISPRMAXTM。使用系统的DOE(实验设计)方法以96孔格式使用六种不同细胞系筛选超过60种转染试剂。参见方法部分。基因组切割效率被用作产量。这里，在四种不同的细胞系(A549、HEK293、海拉(Hela)以及HepG2)中仅显示了48种试剂(x轴，箱)。转染试剂47(箭头)显示CRISPRMAXTM。细胞类型的图例：上至下的组：A549、HEK293、海拉、HepG2.％InDel：“插入和缺失百分比。”图2.描述使用CRISPRMAXTM进行细胞转染的一般方案的示意图。图3A至3I.Cas9RNP复合物和Cas9CRISPRMAXTM复合物的稳定性。在培养基中制备Cas9RNP复合物和CRISPRMAXTM的主混合物。Cas9RNP、CRISPRMAXTM和Cas9CRISPRMAXTM复合物的温育时间是因变量。在指示的时间点，将Cas9RNP复合物在中的等量样本加入至CRISPRMAXTM的等量样本，并在分别加入至A549、HEK293以及海拉细胞之前温育指示的时间。转染后48小时，测定基因组切割效率。图3A至3C：Cas9RNP复合物分别在A549、HEK283以及海拉细胞中的稳定性。图3D至3F：于中的CRISPRMAXTM分别在A549、HEK283以及海拉细胞中的稳定性。图3G至3I：Cas9RNP和CRISPRMAXTM复合物分别在A549、HEK283以及海拉细胞中的稳定性。图4A至4C.调节转染效率的因素。Cas9RNP通过CRISPRMAXTM的递送。将A549、HEK293、HepG2、海拉、MCF-7以及U2OS以两种细胞密度接种在96孔板上，然后用40ngCas9蛋白和8.5nggRNA(1X)，80ngCas9蛋白以及17nggRNA(2X)或120ngCas9蛋白和25.5nggRNA(3X)，使用0.2或0.4μl的CRISPRMAXTM转染。在转染后48小时测定编辑效率。使用AlphaImager确定InDel百分比，并使用JMP11软件处理得到的数据。在六种不同细胞系上进行％InDel与Cas9RNP剂量(图4A)、细胞密度(图4B)和转染试剂的量(图4C)的ANOVA(方差分析)分析。图5A至5C.使用CRISPRMAXTM的细胞毒性。(图5A)在转染前(0小时)和转染后48小时(48小时)，通过INCUCYTETM仪器检查A549、海拉以及人表皮角质形成细胞(HEKa)的形态。(图5B)描绘转染后48小时测定的基因组修饰效率的直方图。(图5C)在转染之前(0小时)和转染后48小时通过台盼蓝测量细胞活力。直方图箱图例：0小时(斜条纹)，48小时(实心)。图6A至6F.Cas9RNP和供体DNA的共同递送。将表达EmGFP的质粒DNA与Cas9RNP共转染到HCT116或HEK293细胞中(图6A，6B)。或者，将400bpPCR片段与Cas9RNP共同递送到具有破坏的EmGFP基因的稳定的GripTiteHEK293(HEK293*)(Cas9RNP/D)细胞系中(图6C，6D)。将Cas9RNP或Cas9加供体DNA(Cas9/D)的递送作为对照。转染后48小时，对细胞进行流式细胞术分析和基因组修饰分析。试验一式三份进行。图6E：描述图例中所示条件下的相对百分比的直方图。图6F：描绘GFP+细胞百分比的直方图。直方图图例(从左到右)：Neg、Cas9/D、Cas9RNP、Cas9RNP/D。图7.描绘细胞工程改造中的CRISPR技术的示意图。图8.描绘可用于Cas9的递送格式的示意图。图9.描绘脂质筛选实验设计的示意图。图10A至10F.用Xa系列、Xb系列以及N系列进行的海拉细胞(上排)和A549细胞(下排)的脂质筛选的结果的直方图。在每个直方图箱内，试剂剂量(从左到右依次)为0.1、0.2、0.4以及0.6微升/孔。图11A至11F.用于Cas9/gRNA转染中的肽的转染增强子试验的结果直方图。细胞系(从左到右，从上到下)：U20S、HEK293、海拉、HepG2、A549、MCF7。所有直方图的Y轴都是％-Indel。如所示添加脂质。图12.图描绘了证明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，包含核糖核蛋白复合物、形成脂质聚集体的阳离子脂质和增强子元件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.14 US 62/241,5591.一种组合物，包含核糖核蛋白复合物、形成脂质聚集体的阳离子脂质和增强子元件。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核糖核蛋白复合物包含内切核酸酶和核糖核酸。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述内切核酸酶为CRISPR相关蛋白9(Cas9)并且所述核糖核酸为向导RNA。4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述形成脂质聚集体的阳离子脂质具有下式结构：其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8以及R9独立地为氢、卤素、-CY3、-CN、-C(O)OH、-CH2C(O)OH、-C(O)NH2、-OH、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NO2、-NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC＝(O)NHNH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；L1和L2独立地为-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-、-NHC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、取代或未取代的亚烷基或取代或未取代的亚杂烷基；l为1至8的整数；X-为阴离子；并且Y为-F、-Cl、-Br或-I。5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述形成脂质聚集体的阳离子脂质具有下式结构：其中n为1至6的整数。6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述形成脂质聚集体的阳离子脂质具有下式结构：其中m为1至10的整数；并且o和p独立地为8至30的整数。7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中R1为取代或未取代的杂烷基。8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述增强子元件包含与核定位信号序列共价连接的多胺部分。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述多胺部分是精胺部分。10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述多胺部分是多个精胺部分。11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物，其中所述多胺部分连接到所述增强子元件的N端。12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述增强子元件包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:46的序列。13.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述增强子元件包含至少两个核定位信号(NLS)序列。14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，进一步包含供体核酸。15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，进一步包含真核细胞。16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述真核细胞是多能细胞、淋巴细胞或肝细胞。17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述多能细胞是诱导的多能细胞或胚胎干细胞。18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述淋巴细胞是T细胞。19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含细胞培养物。20.一种形成细胞转染组合物的方法，所述方法包含：(i)使核糖核酸、内切核酸酶以及增强子元件接触，从而形成核糖核蛋白-增强子元件复合物；和(ii)使形成脂质聚集体的阳离子脂质与所述核糖核蛋白-增强子元件复合物接触，从而形成细胞转染组合物。21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(i)的所述接触包括使所述核糖核酸与所述内切核酸酶接触，从而形成核糖核蛋白。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述核糖核蛋白与所述增强子元件接触，从而形成所述核糖核蛋白-增强子元件复合物。23.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(i)的所述接触包含：(ia)使所述核糖核酸与所述内切核酸酶接触，从而形成核糖核蛋白；和(ib)使所述核糖核蛋白与所述增强子元件接触，从而形成所述核糖核蛋白-增强子元件复合物。24.根据权利要求20或23中任一项所述的方法，其中所述核糖核蛋白-增强子元件复合物位于第一容器中，并且所述形成脂质聚集体的阳离子脂质位于第二容器中。25.根据权利要求24所述的方法，其中在所述第二容器中使所述核糖核蛋白-增强子元件复合物与所述形成脂质聚集体的阳离子脂质接触。26.根据权利要求24所述的方法，其中在所述第一容器中使所述核糖核蛋白-增强子元件复合物与所述形成脂质聚集体的阳离子脂质接触。27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中步骤(i)的所述接触在生理学上可接受的溶液中。28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中步骤(ii)的所述接触在生理学上可接受的溶液中。29.根据权利要求27或28中任一项所述的方法，其中所述生理学上可接受的溶液是细胞培养基。30.根据权利要求20-29中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶是CRISPR相关蛋白9(Cas9)，并且所述核糖核酸是向导RNA。31.根据权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸是向导RNA。32.根据权利要求20-31中任一项所述的方法，其中所述形成脂质聚集体的阳离子脂质具有下式结构：其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8以及R9独立地为氢、卤素、-CY3、-CN、-C(O)OH、-CH2C(O)OH、-C(O)NH2、-OH、-SH、-SO2Cl、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NO2、-NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC＝(O)NHNH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；L1和L2独立地为-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-、-NHC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2NH-、-NHS(O)2-、取代或未取代的亚烷基或...

【专利技术属性】
技术研发人员：于昕，X·梁，X·德默勒拉特杜居，R·J·波特，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US