一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，特征是将6‑氨基‑2‑甲基喹啉溶于乙腈中，加入N‑溴代琥珀酰亚胺反应，得到中间体1；将其溶于水、乙醇和甲苯混合溶液中，加入3‑(N,N‑二甲氨基)苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碳酸钠，氮气保护下回流反应得到中间体2；用盐酸溶解中间体2，在冰水浴条件下将亚硝酸钠加入至上述溶液，用氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，分离提纯即得到3‑甲基‑11‑(N,N‑二甲氨基)噌啉并[3,4‑e]喹啉，即AzosD；其具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力强、细胞核的靶向性高，可应用于活体细胞中细胞核的特异性染色。在细胞核形态的长时间监测和细胞生理过程中细胞核形态变化的观测领域具有广泛的应用前景。

Nucleic acid fluorescent probe for nuclear staining and preparation method thereof

The invention discloses a method for the preparation of nucleic acid fluorescent probe compound AzosD for nuclear staining, which is characterized by dissolving 6 amino acid 2 methyl quinoline in acetonitrile and adding N to brominide reaction to obtain intermediate 1, which is dissolved in a mixture of water, ethanol and toluene, and is added to 3 (N, N two methylamino). Benzyl boric acid, four (three phenyl phosphine) palladium and sodium carbonate were obtained by reflux under nitrogen protection, 2 of the intermediate was reflued, 2 was dissolved with hydrochloric acid, sodium nitrite was added to the above solution under the ice water bath and pH to neutrality of the solution was adjusted by sodium hydroxide solution, and the separation and purification of N, N two methylamino miso [3,4 e] quinoline, which is AzosD, has good photobleaching effect, high biocompatibility, strong anti enzymatic ability and high targeting of nucleus, and can be applied to the specific staining of cell nuclei in living cells. It has a wide application prospect in the field of long-term monitoring of nuclear morphology and observation of changes in nuclear morphology in the process of cell physiology.

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法
本专利技术属于细胞核荧光探针
，具体涉及一种用于细胞核染色的核酸荧光探针3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉(AzosD)及其制备方法。
技术介绍
随着科学技术的发展，人类对细胞核的认识越来越深刻。细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的调控中心。细胞核是细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。核酸是与生命活动和疾病密切相关的生物大分子。因此，细胞核的染色、追踪及形态观察对于了解整个细胞的生命过程具有重要的意义。对细胞核的成像通常采用荧光靶向成像的方法[J.Yan,W.He,N.Li,M.Yu,Y.Du,B.Lei,P.X.Ma,Biomaterials2015,59,21-29.]。目前已经商业化的细胞核靶向荧光染料包括溴化乙锭、碘化丙啶、DAPI、Hoechst等。这些荧光染料对细胞核具有特异性的染色作用。然而，这些荧光染料在溶液状态，通常面临着易于发生光漂白、生物毒性大、抗生物代谢能力低等问题。因此，期待开发具有较高的荧光量子产量、良好的生物相容性、高的光稳定性及抗酶解代谢、且长时间稳定定位于细胞核的荧光染料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法，以克服现有技术的上述缺陷。本专利技术的用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD，其特征在于是结构式为的3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉(AzosD)。其核磁共振氢谱是：1HNMR(400MHz,CDCl3,TMS):δ＝9.36(d,J＝8.7Hz,1H),8.68(d,J＝9.1Hz,1H),8.56(d,J＝9.4Hz,1H),8.25(d,J＝9.1Hz,1H),7.70(d,J＝2.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,1H),7.43(d,J1＝2.6,J2＝9.4Hz,1H),3.28(s,6H),2.85(s,3H)ppm；其核磁共振碳谱是：13CNMR(100MHz,CDCl3,TMS):δ＝159.4,151.7,149.2,144.3,142.6,134.9,132.7,131.6,131.0,123.9,122.3,121.7,117.6,116.9,101.3,40.5,25.0ppm；其高分辨质谱是：HRMS(ESI)m/z:[M+H]+calcd.forC18H17N4:289.1448；found289.1449。本专利技术的用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，其特征在于：先将1.26mmol6-氨基-2-甲基喹啉溶于100ml乙腈中，加入1.33mmolNBS和催化量的硅胶，反应12-18h，经旋干、硅胶柱色谱提纯，得到中间体1；所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯；再将90mg上述中间体1溶于10ml的由水、乙醇和甲苯按体积比1:1:3-4配制的混合溶液中，然后依次加入63mg3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、10mg四(三苯基膦)钯和320mg碳酸钠，在氮气保护下60-100℃回流反应24h，萃取真空减压除去有机相，柱色谱分离得到淡黄色固体状产物中间体2；用30ml浓度为6M的盐酸溶解42mg的中间体2，并冷却到-5-10℃；把1-5倍当量亚硝酸钠溶解到另一份30ml浓度为6M的盐酸中，缓慢滴加至中间体2的盐酸溶液中，搅拌反应30min后，用10％的氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，萃取、旋干后分离提纯，即得到细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD。上述荧光探针化合物AzosD的合成路线可表示为：本专利技术的荧光探针化合物AzosD在500-600nm波段有较强的荧光发射。在含有该染料的培养基中培养细胞1h后，即可在激光共聚焦显微镜下观测到明显的细胞内荧光。本专利技术的荧光探针AzosD基本细胞毒性很小，在正常染色浓度下处理细胞24h，细胞存活率均高于72％。由于本专利技术的细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，采取了先将6-氨基-2-甲基喹啉溶于乙腈中，加入N-溴代琥珀酰亚胺和硅胶反应，得到中间体1；再将中间体1溶于水、乙醇和甲苯混合溶液中，加入3-(N,N-二甲氨基)苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碳酸钠，氮气保护下回流反应得到中间体2；用盐酸溶解中间体2，在冰水浴条件下将亚硝酸钠固体加入至上述溶液，用氢氧化钠水溶液调节溶液的pH至中性，分离提纯后得到荧光探针染料AzosD。该细胞核荧光探针AzosD具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力强、细胞核靶向性高、可长时间监控活体细胞内细胞核形态变化等优点，可应用于活体细胞中细胞核的特异性染色。本专利技术原料易得，反应条件温和，操作简单，成本低。经研究表明，本专利技术的荧光探针AzosD在500-600nm范围具有良好的荧光性质，能够对细胞(如RAW264.7)中的细胞核激光共聚焦成像。RAW264.7细胞被荧光探针AzosD染色后，可清晰地观察到化合物AzosD对RAW264.7细胞的细胞核具有较高的成像能力，可为跟踪细胞核在细胞内的变化提供有效的可视化工具，它的光稳定性好、荧光量子产量高、生物毒性低。本专利技术的核酸荧光探针AzosD，是具有细胞核靶向功能的荧光探针。该荧光探针的化学性质稳定，细胞毒性低，可与DNA相互作用，呈现出荧光增强的效果，具有抗光漂白效果好、生物相容性高、抗酶解能力强、细胞核靶向性高、可长时间监测活体细胞内细胞核形态变化等优点，对细胞无损伤，细胞核定位能力强，可应用于活体细胞中细胞核的特异性染色，进行活体细胞检测。在细胞核形态长时间监测、细胞生理过程中细胞核形态变化的观测领域具有广泛的应用前景。附图说明图1是本专利技术的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD在乙腈中的可见紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图。图2是本专利技术的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD在不同浓度DNA存在下的荧光光谱图。图3是本专利技术的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD荧光强度随DNA浓度的变化的关系图。图4是本专利技术的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD的不同浓度对细胞存活率(培养24h)的影响。图5是本专利技术的用于细胞核染色的核酸荧光探针AzosD与商用细胞核染色剂DAPI对细胞荧光共聚焦显微成像。其中图5a是商用细胞核染色剂DAPI着色的RAW264.7细胞的荧光共聚焦显微照片；图5b是采用本专利技术的核酸荧光探针AzosD着色的RAW264.7细胞的荧光共聚焦显微照片；图5c是明场图片；图5d是叠合的照片图；图6是图5a和5b划线区域的荧光强度变化曲线；图7是本专利技术的细胞核的荧光探针AzosD与商品细胞核染色剂DAPI间的共染色轮廓图。具体实施方式下面通过具体实施例进一步详细说明本专利技术一种用于细胞核染色的核酸荧光探针及其制备方法。实施例1：A、中间体1的制备室温条件下，将1.26mmol6-氨基-2-甲基喹啉溶于乙腈中加入到250ml烧瓶中，然后缓慢加入1.33mmolN-溴代琥珀酰亚胺和催化量的硅胶，继续搅拌，15min后瓶中液体变为深棕色，薄层色谱法判定反应有新点生成，原料未反应完全，继续反应12h。反应结束后，乙酸乙酯萃取，旋干溶剂，残余物经色谱柱(乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD，其特征在于是结构式为

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD，其特征在于是结构式为的3-甲基-11-(N,N-二甲氨基)噌啉并[3,4-e]喹啉。2.权利要求1所述用于细胞核染色的核酸荧光探针化合物AzosD的制备方法，其特征在于：先将1.26mmol6-氨基-2-甲基喹啉溶于100ml乙腈中，加入1.33mmolNBS和催化量的硅胶，反应12-18h，经旋干、硅胶柱色谱提纯，得到中间体1；所用洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯；再将90mg上述中间体1溶于10ml的由水、乙醇和甲苯按体积比1:1:3-4配制的混合溶液中，然后依次加入63mg3-(N,...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋钦华，李琛，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34