高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法技术

本发明专利技术提供细小病毒的感染滴度为109TCID50/mL以上且前述细小病毒的感染滴度(TCID50/mL)与杂质蛋白质浓度(ng/mL)的比大于5000：1，来源于非浓缩的细胞培养上清的细小病毒及这样的高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法。

Method for producing high infection titer and high purity parvovirus

The present invention provides that the infection titer of parvovirus is above 109TCID50/mL and the ratio of the infection titer of the parvovirus (TCID50/mL) to the impurity protein concentration (ng/mL) is greater than that of 5000:1, derived from the parvovirus of the non concentrated cell culture supernatant and the production method of such high infection titer and high purity parvovirus.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法
本专利技术涉及在培养上清中产生高感染滴度且高纯度的细小病毒的方法和利用该方法得到的高感染滴度且高纯度的细小病毒。
技术介绍
病毒感染包括人在内的众多动植物、微生物并扩增。某些病毒是具有DNA作为基因组的DNA病毒，另外某些病毒是具有RNA作为基因组的RNA病毒，各病毒分别具有不同的增殖机理。人等动物感染时，引起病毒传染病的病毒也很多。病毒不能单独增加，却能感染其它动物/植物/微生物的细胞，利用该细胞的能力而增加。将病毒能够感染并增殖的细胞称为该病毒的“宿主细胞”。病毒能够感染/增殖的宿主细胞的种类根据病毒的种类而决定。细小病毒为小型的单链DNA病毒，为直径小至约20nm的正20面体病毒，且不具有被膜(非专利文献1)。细小病毒感染动物而引起疾病。作为该疾病，已知有：B19细小病毒对人引起的传染性红斑、贫血、关节炎，除此之外还有由猴细小病毒(SPV)导致的贫血、由猫细小病毒(FPV)导致的猫的肠炎/白血球减少/失调症、由狗细小病毒(CPV)导致的狗的肠炎/心肌炎、由猪细小病毒(PPV)导致猪的死胎、由牛细小病毒(BPV)导致的牛的肠炎、由鹅细小病毒(GPV)导致的鹅的肠炎/心肌炎、由小鼠微小病毒(MVM)导致的小鼠的肠炎/肝炎等(非专利文献2、非专利文献3)。细小病毒作为引起狗、猫这样的人类饲养的动物的疾病的原因的病原体，是重要的。已知，如果狗感染狗细小病毒，则如前述那样引起肠炎，产生激烈的痢疾、呕吐，甚至死亡(非专利文献3)。如果猫感染细小病毒，则有时会引起急性肠炎、白血球减少，在二次感染时也会有死亡的可能性；另外，如果胎儿、新生儿感染，则中枢神经、胸腺受到损害，引起运动失调，有时也会死亡。为了防止细小病毒传染病而进行了有关细小病毒的疫苗的研究(专利文献1、专利文献2)。这些研究中，需要生产病毒来使用。多数病毒可以通过培养宿主细胞，使其感染病毒而增殖，从而进行生产。使病毒弱毒化或灭活的疫苗生产也可按照与病毒生产同样的步骤而实现。在制药行业中，为了保证基因重组药品(生物药品)、抗体药品等来源于生物的药品不被病毒污染(病毒安全性)，而需要对于制造工序的病毒清除(去除性能)进行评价。因此，通过向各工序前的药品中间产品中添加病毒并且对工序前后的病毒量进行定量，从而能够对各个工序所具有的病毒清除进行测定。特别是，用针对生物制剂的制造工序的病毒清除评价中所使用的病毒种类的选择方法而规定的ICH(InternationalConferenceonHarmonizationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse：日美EU医药品法规协调国际会议)指导方针所记载的方法实施的血浆分级制剂的病毒清除评价中，细小病毒的一种猪细小病毒(PPV：PorcineParvovirus)被频繁使用，生物药品的病毒清除评价中，细小病毒的一种小鼠微小病毒(MVM：Minutevirusofmice)被频繁使用。由此，在生物制剂的制造工序的病毒清除评价中频繁使用了细小病毒。为了生产病毒，有如下方法：使用实验动物的方法、使用鸡蛋的方法、使用组织培养/培养细胞的方法(非专利文献4)。使用实验动物、鸡蛋的方法存在成本高的缺点。代替其的方法有使用培养细胞的方法。细小病毒的生产也通过使用培养细胞的方法进行(专利文献1)。为了生产细小病毒等病毒，通常进行使宿主细胞的培养体系感染种病毒，使病毒增殖并进行回收的方法。此处所说的种病毒是指将病毒增殖初始所使用的少量的病毒视为“种”的称呼。现有的病毒生产中，使宿主细胞感染种病毒的时机通常是宿主细胞达到汇合(confluent)且形成为单层状态的阶段(非专利文献4、专利文献3～6)。即，通常将宿主细胞接种在培养容器，使之增殖，在宿主细胞增殖并铺展在培养容器的整个底面的状态下接种种病毒，这是因为能够感染的细胞高密度地存在的状况是提供生产更多病毒的场所的体系。从将宿主细胞接种在培养容器至其到达该汇合的状态为止，通常需要2～3天(非专利文献4)。该汇合状态下，宿主细胞为稳定期，不再增殖。因此，现有技术在完成宿主细胞的增殖培养工序之后，在不再发生细胞增殖的培养环境下开始病毒感染，与宿主细胞由于病毒感染而死亡同时进行从而在培养上清中生产病毒。这样的方法对于细小病毒也不例外，通过使汇合状态的细胞感染的方法进行病毒生产(非专利文献5、非专利文献6)，得到的细小病毒的感染滴度为105～107TCID50/mL。在现有的培养体系中，在细胞数最多的状态即汇合的状态下向宿主细胞中添加细小病毒，添加的细小病毒在宿主细胞内增殖并伴随宿主细胞的死亡而增加。通过在细小病毒感染滴度变得最高的时期对培养上清进行回收，从而能够对最高感染滴度的细小病毒溶液进行回收。对于用该方法在培养上清中得到的细小病毒，当然以悬浮在供于细胞培养的培养基中的状态被回收。另外，对于如上述那样得到的细小病毒溶液，也进行去除杂质。作为去除方法，通过低速离心分离从而去除细胞的碎片等杂质而进行(非专利文献7)。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2007/125605号公报专利文献2：日本特表平10-508485号公报专利文献3：日本特开2009-297036号公报专利文献4：日本特许第2655876号公报专利文献5：日本特开昭58-22008号公报专利文献6：日本特开昭61-24370号公报非专利文献非专利文献1：病毒·细菌感染新文件1997永井美之·渡边治雄编、羊土社：p.68(ウイルス·細菌感染newファイル1997永井美之·渡邊治雄編、羊土社：p.68)非专利文献2：病毒学1997畑中正一编、朝仓书店：222-223(ウイルス学1997畑中正一編、朝倉書店：222-223)非专利文献3：M.Azetakaet.al1980Jpn.J.Vet.Sci.43:243-255非专利文献4：病毒实验学总论国立预防卫生研究所学友会编1973：61、113、131和166-176(ウイルス実験学総論国立予防衛生研究所学友会編1973：61、113、131和166-176)非专利文献5：P.A.Bachmann1972Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(140)4:1369-1374非专利文献6：P.A.Bachmannetal.1976Zbl.Vet.Med.B.No.23:355-363非专利文献7：病毒实验学各论1973国立预防卫生研究所学友会·编22-23(ウイルス実験学各論1973国立予防衛生研究所学友会·編22-23)
技术实现思路
专利技术要解决的问题如上所述，为了用于来源于生物的药品的病毒安全性评价、疫苗生产，而期望生产出高感染滴度的细小病毒。另外，如上所述的生物制剂的制造工序的病毒清除评价中，也希望生产高感染滴度的病毒。用于该评价的病毒去除滤器的病毒清除试验通过将实际生产工序按比例缩小的模型工序来实施，但是对于该病毒清除试验所要求的点有：第一，是不产生滤器堵塞程度的病毒悬浮液添加量；第二，是表现出评价工序的病毒清除数值即对数去除率(LRV)为4以上的添加量。对于前者，由于包括工序的流速的各参数必需与实际生产工序相同(WHOTe本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法，其包括如下工序：工序(a)，对于每个感染时细胞密度(A)，事先另行计算出宿主细胞感染细小病毒时的培养基材料的细胞密度每24小时的经时变化；工序(b)，基于在工序(a)中事先计算出的细胞密度的经时变化来确定：(b1)自感染起至细胞密度的经时变化的峰值时为止的时间(Tmax)、(b2)Tmax时的细胞密度(Bmax)与A满足以下的式(1)的A1、(b3)这样的A1中最大的感染时细胞密度(Amax)、及(b4)满足以下的式(2)的A2，Bmax/A1＞1.2    式(1)Amax≥A2≥Amax/10    式(2)；工序(c)，在包含A2的感染时细胞密度的宿主细胞和血清培养基的所述培养基材料中以感染复数(MOI)成为0.001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述A2是由工序(b)的(b4)中确定的；工序(d)，将工序(c)中得到的包含宿主细胞和细小病毒的培养物培养Tmax以上且少于Tmax+48小时的时间，所述Tmax是由工序(b)的(b1)中确定的；工序(e)，将工序(d)的培养上清更换为无血清培养基，培养12小时以上；以及工序(f)，对包含通过工序(e)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收，所述工序(b)中，不存在满足式(1)的A的情况下，采用其它的感染时细胞密度A并再次实施工序(a)和工序(b)。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.06 JP 2015-2187751.一种高感染滴度且高纯度的细小病毒的产生方法，其包括如下工序：工序(a)，对于每个感染时细胞密度(A)，事先另行计算出宿主细胞感染细小病毒时的培养基材料的细胞密度每24小时的经时变化；工序(b)，基于在工序(a)中事先计算出的细胞密度的经时变化来确定：(b1)自感染起至细胞密度的经时变化的峰值时为止的时间(Tmax)、(b2)Tmax时的细胞密度(Bmax)与A满足以下的式(1)的A1、(b3)这样的A1中最大的感染时细胞密度(Amax)、及(b4)满足以下的式(2)的A2，Bmax/A1＞1.2式(1)Amax≥A2≥Amax/10式(2)；工序(c)，在包含A2的感染时细胞密度的宿主细胞和血清培养基的所述培养基材料中以感染复数(MOI)成为0.001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述A2是由工序(b)的(b4)中确定的；工序(d)，将工序(c)中得到的包含宿主细胞和细小病毒的培养物培养Tmax以上且少于Tmax+48小时的时间，所述Tmax是由工序(b)的(b1)中确定的；工序(e)，将工序(d)的培养上清更换为无血清培养基，培养12小时以上；以及工序(f)，对包含通过工序(e)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收，所述工序(b)中，不存在满足式(1)的A的情况下，采用其它的感染时细胞密度A并再次实施工序(a)和工序(b)。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细...

【专利技术属性】
技术研发人员：泽村佳之，柳田恒一郎，
申请(专利权)人：旭化成医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP