生产色谱介质的方法及色谱介质技术

本发明专利技术涉及一种改进色谱珠的方法。更严密地说，本发明专利技术涉及一种生产含葡聚糖的多孔介质的新方法和用这种方法生产的色谱介质。在该方法中，色谱介质经历葡聚糖酶处理，导致介质的压流性质改进。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产色谱介质的方法及色谱介质专利
本专利技术涉及一种改进色谱珠的方法。更严密地说，本专利技术涉及一种生产含葡聚糖的多孔介质的新方法和用这种方法生产的色谱介质。在该方法中，色谱介质经历葡聚糖酶处理，导致介质的压流性质改进。背景在生物技术中，最广泛使用的分离方法之一是色谱。术语色谱包括一系列密切相关的分离方法。区别色谱与大多数其它物理和化学的分离方法的特征是两个互相不混溶的相接触，其中一个相是静止的，而另一个是流动的。引入流动相的样品混合物经历了一系列的相互作用，即静止相和流动相之间的分配，因为它被流动相携带通过系统。相互作用利用样品中各组分的物理或化学性质的差异。这些差异在穿过包含静止相的柱的流动相的影响下控制各个组分的迁移率。分离的组分以一定的顺序出现，这取决于它们与静止相的相互作用。最少延迟的组分首先洗脱，最强烈保留的材料最后洗脱。随着样品组分从柱洗脱，当一个组分被延迟足以防止与相邻溶质的区带重叠时获得分离。最常见的色谱类型之一是尺寸排阻色谱(SEC)。预填充的SEC柱常用于蛋白制备和纯化领域。然而，对于许多色谱产品，仍有希望改进流动性质，同时维持分辨率。对于SEC分离，还存在关于这些分离与其它液相色谱技术像离子交换或亲和力色谱比较通常是相当慢的问题。专利技术概述本专利技术的目的是提供一种生产色谱介质的方法，其提供与现有技术比较具有改变的性质的介质。在第一方面，本专利技术提供一种生产色谱介质的方法，其用包含与孔内和珠表面上的葡聚糖偶联的多孔珠的色谱介质起始，包括使色谱介质经历葡聚糖酶处理的步骤。优选地，葡聚糖酶被偶联于支持粒子。在一个实施方案中，支持分子大于要处理的色谱介质的孔。在这种情况下，葡聚糖酶不能进入孔，只有珠外面的葡聚糖将被处理/除去。支持粒子或分子可以是天然或合成的色谱珠或PEG(聚乙二醇)或合适大小的任何其它分子或粒子。在一个实施方案中，支持粒子是磁性的，优选磁性色谱珠。在本专利技术的另一个实施方案中，葡聚糖酶偶联的支持粒子可进入色谱介质的孔。在这种情况下，不仅所述珠表面上的葡聚糖，而且孔内的葡聚糖也将被葡聚糖酶处理。色谱介质优选地由天然或合成的树脂制得。一些非限制性实例是纤维素、琼脂糖、壳聚糖、二氧化硅(多孔玻璃)、氧化铝、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯：即聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醚(polyvinyleters)、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚烯烃：即聚乙烯、聚丙烯、聚酯：即聚二醇、聚丙交酯。在优选的实施方案中，色谱介质由琼脂糖制得，优选琼脂糖是交联的。在进一步的实施方案中，偶联于色谱介质的葡聚糖具有配体，例如离子交换、亲和力、疏水相互作用或多模式配体。在这个实施方案中，在所述珠表面上的葡聚糖偶联配体将通过葡聚糖酶处理去除，但如果支持粒子足够大而不能进入孔，则附接于孔内的葡聚糖的配体将保持完整。这样，可生产具有无活性的外表面和具有活性配体的内核的色谱介质。在第二方面，本专利技术涉及依据以上方法生产的色谱介质。在优选的实施方案中，所述珠由交联的琼脂糖制得，且葡聚糖没有任何配体。这在实施例中描述并将提供具有改进的流动性质的新型SEC介质。附图简述图1是用PEG化葡聚糖酶处理含葡聚糖的色谱珠的示意图；图2显示葡聚糖酶处理之前、期间和之后的色谱珠；图3是具有处理前(未处理的珠)和处理后的珠的填充柱的示意图；和图4是显示未处理的色谱介质对比葡聚糖酶处理的色谱介质的压流性质的图。专利技术详述本专利技术涉及具有孔内的葡聚糖的多孔色谱珠。葡聚糖在制备期间附接在所述珠的孔内并限定色谱树脂的选择性，因而为获得色谱树脂的期望功能所需要。葡聚糖共价连接于交联的琼脂糖，优选高度交联的琼脂糖。然而，本专利技术人已经发现这些类型的色谱珠具有流速的限制并发现这是由于在这些类型的珠的外表面上存在葡聚糖链导致。在一个实施方案中，本专利技术涉及一种除去外表面结合的葡聚糖，同时不影响在珠的孔内附接的葡聚糖的方法，如在图1中说明的。在本专利技术的这个实施方案中，色谱珠用偶联于支持粒子的葡聚糖酶处理，所述支持粒子大于要处理的色谱介质的孔，如在图2中说明的。如在本专利技术的这个实施方案中，用粒子结合的葡聚糖酶的处理将仅仅降解结合于所述珠的外表面的葡聚糖，但使孔内附接的葡聚糖链保留完整。结果是具有改进的流动性质并维持选择性的新型色谱树脂。本专利技术人已经发现附接于所述珠的外表面的葡聚糖对选择性没有影响或具有可以忽略的/有限的影响，但它对树脂的流动性质(即填充柱内色谱珠之间的液体流动)具有负面影响，如在图3中说明的。多少葡聚糖会被降解的程度可通过支持粒子的大小及其进入含葡聚糖色谱珠的孔的能力进行控制。通过葡聚糖酶处理，孔内及孔外的葡聚糖的量可通过使用比色谱树脂的孔更小的支持粒子来改变。通过控制支持粒子的大小和色谱树脂的孔径，各种类型的色谱介质可被设计用于多种应用和选择性，例如旨在用于不同大小的靶标分子。在图1和2中，可看出偶联于大于含葡聚糖的色谱树脂的孔的支持粒子的葡聚糖酶如何仅降解在色谱树脂表面上的葡聚糖。这种处理导致在粒子之间的畅通的流道。在图3，可看出葡聚糖酶处理如何打开在示意性填充色谱柱内的树脂之间的流道，使得具有更好的压力和流动性质。实施例本专利技术人已经发现葡聚糖偶联的介质，例如Superdex200Increase(GEHealthcareBio-SciencesAB)，可用葡聚糖酶处理以增加流动性质，而不损失分辨率。依据本专利技术的葡聚糖酶处理可除去色谱珠表面上以及所述珠的孔内的葡聚糖。本专利技术的方法与使用倾析比较有很大的改进，以获得更好的流动性质，而不削弱分辨率。材料名称注释来自青霉菌(Penicillumsp.)的葡聚糖酶得自SigmaAldrich,Mw约64kDaNHSMagSepharoseGEHealthcareBio-SciencesAB,10.1mmolNHS/ml凝胶TRIS氯化钠(NaCl)乙酸碳酸氢钠(NaHCO3)葡聚糖ABGEHealthcareBiosciencesABSuperdex75Increase原型A17-5S缓冲液和葡聚糖溶液Tris缓冲液-50mMTris,1MNaCl,pH=8.0乙酸盐缓冲液-50mM乙酸盐pH5.0偶联缓冲液–0.48MNaHCO3,1.5MNaCl,pH8.32%葡聚糖AB溶液pH5：将2g葡聚糖AB溶于100ml乙酸盐缓冲液pH5(见上文)。实施例1：葡聚糖酶与NHSMagSepharose的偶联葡聚糖酶依据以下反应偶联于NHS活化的磁珠。反应偶联将葡聚糖酶(400mg)加入在15mlFalcon管内的7ml偶联缓冲液中。使葡聚糖酶在振动台上溶解30分钟。在p4玻璃滤器中，用冰冷的1mMHCl(5x40ml)洗涤约20mlNHSMagSepharose(10.1µmolNHS/ml)。然后在滤器上沥干凝胶并将17g称重到(连同5ml1mMHCl)100mlDURAN烧瓶中。将得自上面的葡聚糖酶溶液加入NHSMagSepharose凝胶中并开始搅拌。然后于RT搅拌浆液2小时。然后在玻璃滤器(p4)上用Tris缓冲液pH81GV(1凝胶体积020ml)x3、乙酸盐缓冲液pH51GVx3，然后再次用Tris缓冲液1GVx3洗涤NHSMagSepharose凝胶。然后将40mlTris缓冲液加入滤器上的凝胶中，然后在滤器本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产色谱介质的方法，其用包含与孔内和珠表面上的葡聚糖偶联的多孔珠的色谱介质起始，包括使色谱介质经历葡聚糖酶处理的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.06 GB 1519668.61.生产色谱介质的方法，其用包含与孔内和珠表面上的葡聚糖偶联的多孔珠的色谱介质起始，包括使色谱介质经历葡聚糖酶处理的步骤。2.依据权利要求1的方法，其中葡聚糖酶被偶联于支持粒子。3.依据权利要求2的方法，其中支持分子大于要处理的色谱介质的孔。4.依据权利要求2的方法，其中支持分子包含天然或合成的色谱珠或PEG(聚乙二醇)。5.依据权利要求2-4的任一项的方法，其中支持粒子是磁性的。6.依据权利要求4或...

【专利技术属性】
技术研发人员：N诺尔曼，M阿尔戈特斯森，SD埃里克斯森，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE