基于人呼吸道合胞病毒(HRSV)病毒样颗粒(VLPS)的疫苗制造技术

本申请描述了在其表面展示抗原性副粘病毒(如，RSV和/或MPV)蛋白的病毒样颗粒。还描述了制备和使用这些VLP的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于人呼吸道合胞病毒(HRSV)病毒样颗粒(VLPS)的疫苗相关申请的交叉引用本申请要求2015年08月31日提交的美国临时申请号62/212,306的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。有关联邦资助的研究的声明本专利技术部分地得到国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)的一项或多项资助。美国政府可享有本专利技术的某些权利。
本专利技术涉及包含人呼吸道合胞病毒(hRSV)病毒样颗粒(VLP)的组合物、制备和使用这些hRSVVLP的方法，其包括产生和生产基于hRSVVLP的疫苗。具体而言，本公开包括用于开发新型基于VLP的疫苗系统的策略和方法，该系统能保护人类免受不同hRSV血清型(A和B型)的感染。本文还描述了生产展示某些优化抗原性构型的VLP和佐剂配方的方法。这些VLP特征性地具有构象表位，所述构象表位与产生增强的中和免疫应答相关。可在已瞬时或稳定转染蛋白质表达载体的真核细胞的悬浮培养物中生产VLP疫苗。VLP在细胞膜组装，并释放到培养基中。经纯化、浓缩和配制之后，可通过适当的途径给予疫苗(例如通过粘膜或胃肠道外途径)，并引起能抗hRSV病毒血清型A和B型感染保护的免疫应答。
技术介绍
人呼吸道合胞病毒(RSV)导致世界性严重小儿肺病的首要原因。几乎所有婴儿在2岁之前都至少被RSV感染一次。RSV感染的临床谱范围从上呼吸道中的鼻炎覆盖到下呼吸道中的肺炎和支气管炎。全球范围内的流行病学研究显示2-5％RSV感染儿童需要住院，在早产儿中具有最严重的发病率和致死性比例失调影响。RSV疾病每年导致100,000～200,000例死亡。据信，严重RSV感染会使儿童易于发生喘鸣以及未来疾病和可能的哮喘。重要的是，RSV感染引发中和抗体和T细胞应答，其仅可持续有限的时间段；由此，患者时常对重复感染没有保护能力。并且，老年人在重复感染时显示严重RSV疾病的高风险，其具有很高的致病性和致死率。CDC报道称RSV感染在美国65周岁以上的成人中每年导致177,000例住院和14,000例死亡。呼吸道合胞病毒是一种单链负义非分段包膜RNA病毒，其被分类为副粘病毒科肺病毒属的一员。病毒基因组(15,522个核苷酸)编码11种蛋白质，8种结构蛋白(N、P、M、M2-1、SH、G、F和L)以及3种非结构蛋白(NS1、NS2、M2-2)。基因组核包含在病毒包膜中，该包膜以M蛋白为主，点缀有三种表面跨膜糖蛋白G、F和SH。G蛋白是主要的附着蛋白，而F蛋白则介导膜融合以及随后的复制合胞体形成。RSVA和B亚群间的抗原二态性(antigenicdimorphism)主要与G蛋白相关，而F蛋白与这两个亚群之间的关系更紧密。G蛋白和F蛋白包含在受感染宿主中引发部分保护性抗体应答的抗原决定簇。G蛋白上的抗原变化是区分两种RSV亚型A和B的主要决定因素。这两种亚型在人体内循环，可能具有类似的发生率和毒性。F蛋白和G蛋白带有某些CTL表位以及抗原性位点，可引发中和抗体。高效价血清中和抗体防止了下呼吸道的RSV感染，为此提供了作为保护相关性的证据。此外，市售预防性MAb帕丽珠单抗靶向高度保守F蛋白中的中和表位。这些数据提供了选择这些RSV表面抗原作为待掺入VLP疫苗表面上的目标物的理由。并且，展示在病毒体表面上的F蛋白迅速改变构象，由融合前亚稳态形式改变为更为稳定的融合后结构。近期研究显示融合前构象具有瞬时表位，与融合后结构所引发出的抗体相比，其能引发出具有更高中和力度的抗体。这些数据为疫苗开发提供了新视角。RSVVLP描述于例如美国专利公开号20080233150和20110097358中。尽管经过了超过50年的研究努力，目前还没有用于控制或防止RSV感染的可用获批疫苗。事实上，RSV疫苗开发已因在1960年代进行的一期临床试验中的有害结果而被限制，该试验中涉及使用臭名昭著的甲醛灭活RSV疫苗(FI-RSV)批号100。给予儿童FI-RSV疫苗导致了RSV自然感染后的疫苗增强性疾病，并造成了80％比例的住院病例以及2例死亡。目前，对于RSV仅能获得的药理学干预是用针对RSV融合糖蛋白(F)的中和单克隆抗体帕丽珠单抗(Synagis，MedImmune公司)进行免疫预防。但是，帕丽珠单抗预防仅限于高风险的婴儿，且其对于发展中国家患者而言成本过高。疫苗学研究显示F糖蛋白似乎是用于引发抗病毒中和抗体的最具有吸引力的靶标。F蛋白在不同RSV分离株之间具有氨基酸序列高度保守性，其位于病毒体的表面，在通过触发病毒体向靶细胞膜融合进行的病毒进入过程中起到关键作用。重要的是，F病毒还决定肺上皮中RSV感染的典型组织学表现，包括伴随细胞病变效果(CPE)的合胞体形成。结构和基因研究显示RSVF在宿主中成熟，并组装成膜锚定的同三聚体。并且，RSVF蛋白聚体前体(F0)是在高尔基体中通过弗林蛋白酶在位点I和II上的切割翻译后活化。该切割过程产生两个亚基，F1和F2，它们通过两个二硫键半胱氨酸-半胱氨酸桥连接，并释放被称为p27的27个氨基酸的短糖蛋白。因此，F1亚基的N末端暴露出疏水融合肽(FP)，其在插入靶标膜中以后引发病毒体-细胞融合。RSVF1的C末端包含细胞溶质尾部(CT)结构域，在病毒体组装期间该结构域与基质蛋白(M)相互作用。RSVF在具有独特抗原性的不同构象间动态折叠：即高度稳定的融合后形式和亚稳态的融合前形式。Magro及其同事(见本专利申请末尾的参考文献26)已证实了融合前F蛋白与融合后结构相比能在人和兔中刺激产生中和活性更高的抗体。随后，McLellan及其同事(25)通过X射线晶体学确定了融合前F蛋白的蛋白质，结构，并鉴别了仅存在于融合前的抗原性位点该位点在F蛋白的融合后结构中不存在。虽然帕丽珠单抗能识别融合后和融合前结构，高度中和性抗体亚类，如5C4、AM22和D25能与融合前抗原性位点特异性相互作用。有趣的是AM14和MPE8中和抗体也能利用其他的抗原性位点非常有效地识别融合前F蛋白。这证明了融合前F蛋白表达适于靶向治疗的多个表位，而这些表位在融合后构象中并不展示。目前并无用于控制、抵御或防止hRSV感染的获批疫苗或特定治疗。通过接种疫苗防止感染代表了具有全球重要性的迫切但未能满足的医疗需求。HRSV疫苗正通过常规策略开发。然而，灭活病毒疫苗在患者中引发了疫苗增强性疾病(13，14，15)。采用RSV活减毒疫苗候选物的临床试验始于1976年。该方法的经历提出了达到疫苗减毒和免疫原性之间平衡的警告。采用中度减毒疫苗的在先尝试伴有相关的副作用，例如鼻充血、发烧、肺炎、咳嗽和中耳炎。而另一方面，发现经较强水平病毒减毒的疫苗没有效果。如本文所述的VLP疫苗在真核细胞中通过某些病毒基因的重组表达产生。获批的VLP疫苗已被证实有效、非常安全且对病毒性疾病(例如乙型肝炎病毒HBV、乳头瘤病毒HPV和戊肝病毒HEV)有很好的耐受性。之前测试用于hRSV的亚基疫苗采用融合后构象的F蛋白配制。然而，更近的研究证明了融合前构象的F蛋白具有引发优异水平中和抗体的能力。我们的RSVVLP疫苗包含且展示F糖蛋白的不同构象(融合后和融合前)，其采用人偏肺病毒(hMPV)的基质蛋白(M)组装。该蛋白质与质膜联合，在病毒体包膜的内小叶(inn本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒样颗粒(VLP)，其包括：至少一种偏肺病毒(MPV)结构蛋白；以及至少一种表面MPV或呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.31 US 62/212,3061.一种病毒样颗粒(VLP)，其包括：至少一种偏肺病毒(MPV)结构蛋白；以及至少一种表面MPV或呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白。2.如权利要求1所述的VLP，其中，所述MPV蛋白包含人MPV(hMPV)基质(M)蛋白。3.如权利要求1或2所述的VLP，其中，所述表面MPV或RSV蛋白包含一个或多个F蛋白、一个或多个G蛋白和/或一个或多个SH蛋白。4.如权利要求3所述的VLP，其中，所述一个或多个F蛋白包含融合前F蛋白构型和/或融合后F蛋白构型。5.如权利要求1-4中任一项所述的VLP，其中，所述RSV和/或MPV蛋白经密码子优化。6.如权利要求1-5中任一项所述的VLP，其中，所述表面蛋白包含对一个或多个氨基酸残基的修饰。7.如权利要求6所述的VLP，其中，所述修饰包括在如下一个或多个残基处的取代：30、32、102、105、145、148、155、290、467、468、106～109和/或133～136，基于SEQIDNO:l编号。8.如权利要求7所述的VLP，其中，在30、32、102、105、145、148、155、290、467和/或468位的一个或多个残基处的取代是用半胱氨酸残基取代野生型残基。9.如权利要求6-8中任一项所述的VLP，其中，所述F蛋白的一个或多个结构域被不同肺炎病毒的结构域替换。10.如权利要求9所述的VLP，其中，所述RSF蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·加拉尔萨，V·西米卡，H·博伊加德，
申请(专利权)人：泰克诺瓦克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US