一种蓖麻原生质体制备和转化方法技术

本发明专利技术公开了一种蓖麻原生质体制备和转化方法。本发明专利技术通过优化蓖麻叶片原生质体分离制备中叶片材料获取时间、切取叶片的形状、酶浓度、酶解时间和离心转速等，并利用自制的简易装置过滤，获得更多活力较强的原生质体，并利用本发明专利技术的方法成功的将外源质粒转化蓖麻叶片原生质体，可以用于进一步的亚细胞定位。本发明专利技术为蓖麻功能基因的分析建立了一套高效的蓖麻叶片原生质体制备和转化方法及亚细胞定位体系，利用这套体系可以高效的获得蓖麻叶片原生质体，为获得进行亚细胞定位提供了前提条件，进一步为蓖麻关键功能基因研究奠定了良好的工作基础，为蓖麻原生质体的应用提供技术支持。

A method for the preparation and transformation of castor protoplast

The invention discloses a method for preparation and transformation of castor protoplast. By optimizing the extraction time of the leaf material, the shape of the leaves, the concentration of enzyme, the time of enzymatic hydrolysis, and the centrifugal speed of the leaves, the invention can obtain more energetic protoplasts by the self-made simple device, and successfully transform the exogenous plasmid into the castor by the method of the invention. The protoplasts of the leaf blade can be used for further subcellular localization. The present invention has established a set of efficient method for the preparation and transformation of castor leaf protoplast and the subcellular location system. This system can efficiently obtain the protoplast of castor bean leaf. It provides the precondition for obtaining the subcellular location, and further studies the key functional genes of castor bean. The work lays a good foundation for the application of castor protoplast.

【技术实现步骤摘要】
一种蓖麻原生质体制备和转化方法
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种蓖麻原生质体制备和转化方法。
技术介绍
原生质体(protoplast)一词是Hanstein在1880年提出的，是指植物细胞去掉细胞壁而被原生质膜包裹的那部分裸露的物质。该裸露的物质具有其自身的全部遗传信息，在适宜的条件下培养，可以再生成和其亲本相似的个体；离体的原生质体具有广泛的用途，不但能通过细胞的融合克服远缘杂交不亲和的障碍，而且是进行基因工程操作，尤其是进行基因的瞬时表达的理想受体，因此科学家们越来越重视原生质体的游离技术。植物原生质体遗传转化常见的方法有基因枪法、农杆菌共培养转化法、电击穿孔转化法和聚乙二醇(PEG)介导转化法等。其中最常用的是PEG介导转化法，该方法不仅成本低，操作简单，而且还可以很大程度地保持原生质体的活性，是进行植物原生质体转化的第一首选。其基本原理是：PEG带有大量负电荷，可以与水分子以及Ca2+结合，并且连接原生质体表面的负电荷，形成静电键，从而引起细胞质膜电荷紊乱甚至会产生微孔，使外源DNA可以通过这些孔隙进入细胞体内。植物种类、原生质体的活力与密度、质粒DNA的浓度与纯度、PEG的分子量和浓度以及处理时间等均会影响转化效率。目前为止由PEG介导的原生质体转化技术在拟南芥和水稻等模式植物中逐渐趋于成熟，然而还有许多非模式植物尚未建立。蓖麻是大戟科蓖麻属一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，具有很高的经济利用价值。目前有关蓖麻原生质体游离和转化的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中无有关蓖麻原生质体制备和转化方法的问题，提供一种操作简便、能高效的获得活力较强的蓖麻叶片原生质体的制备方法，及利用该原生质体进行遗传转化的方法。本专利技术的蓖麻原生质体制备方法，包括以下步骤：a.利用蓖麻完整的种子幼胚培养无菌苗，培养20天后，取叶片并吸干表面水分，舍去主叶脉部分，把叶片切成0.2mm宽细丝，然后将其浸没于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振荡酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纤维素酶RS、8g/L的离析酶R-10、0.5M的甘露醇、20mMMES、10mMCaCl2和1g/L的BSA，余量为水；b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的叶片细丝，收集漂洗后的溶液，利用原生质体过滤装置过滤，收集过滤液，700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心10min，去上清，沉淀即为蓖麻原生质体。优选，所述的无菌苗的培养方法为：挑取成熟饱满的蓖麻种子于蒸馏水中浸泡一天，剥去外壳，使用75体积分数％的乙醇水溶液浸泡1min，再使用质量分数2％的次氯酸钠浸泡并震荡10-15min，最后使用蒸馏水冲洗3-5次后，用无菌镊子剥离蓖麻完整的幼胚接种于MS基本培养基上，25±1℃、光照强度为2000lx、光照12h/黑暗12h的条件下培养。优选，所述的W5溶液含有2mMMES、154mMNaCl、125mMCaCl2和5mMKCl，余量为水。优选，所述的制备得到的蓖麻原生质体用MMG溶液悬浮，制备得到蓖麻原生质体悬浮液；所述的MMG溶液含有2mMMES、0.5mM甘露醇和15mMMgCl2，余量为水。优选，所述的原生质体过滤装置是通过如下方法制备的：将两层300目尼龙膜叠整齐后放置在一个茶漏上，再将另一个相同规格的茶漏放置在尼龙膜上，即制备得到原生质体过滤装置。本专利技术的蓖麻原生质体转化方法，包括以下步骤：a.向待转化质粒中加入适量所述的蓖麻原生质体悬浮液，加入等体积的PEG溶液，轻轻混匀，然后25℃、遮光培养15min；b.加入W5溶液对原生质体进行洗涤，700rpm离心10min，去掉上清收集沉淀，再用WI溶液悬浮原生质体，25℃、遮光培养12h；然后700rpm离心10min，去除上清，沉淀中即含有成功转化的原生质体。优选，所述的PEG溶液含有400g/L的PEG4000、0.2mM甘露醇和100mMCaCl2，余量为水。优选，所述的WI溶液含有4mMMES、0.5mM甘露醇和20mMKCl，余量为水。优选，所述的用于蓖麻原生质体转化的质粒可以是多种常用的质粒，比如载体pUC18-35S-eGFP等。所述的蓖麻原生质体转化方法用于亚细胞定位的用途也属于本专利技术的保护范围。目前有关蓖麻叶片原生质体分离制备及转化的方法还未见报道。本专利技术通过优化蓖麻叶片原生质体分离制备中叶片材料获取时间、切取叶片的形状、酶浓度、酶解时间和离心转速等，并利用自制的简易装置过滤，获得更多活力较强的原生质体，并利用本专利技术的方法成功的将外源质粒转化蓖麻叶片原生质体，可以用于进一步的亚细胞定位。本专利技术为蓖麻功能基因的分析建立了一套高效的蓖麻叶片原生质体制备和转化方法及亚细胞定位体系，利用这套体系可以高效的获得蓖麻叶片原生质体，为获得进行亚细胞定位提供了前提条件，进一步为蓖麻关键功能基因研究奠定了良好的工作基础，为蓖麻原生质体的应用提供技术支持。本专利技术具有以下优点：(1)利用自制的简易装置就可以获得数量较多，质量较好的蓖麻叶片原生质体，并且该装置操作简便，价格低廉。而通常其他实验室过滤原生质体专用的细胞筛造价较高，需要一定的操作技术。(2)本专利技术所建立的蓖麻叶片原生质体分离制备及转化方法，除了叶片材料来源之外，其余操作都无需严格的无菌操作(如原生质体的获取)，操作容易。而传统的方法要求严格的无菌操作，这给整个过程带来了一定的难度。(3)本研究首次报道蓖麻叶片原生质体分离制备及转化方法。附图说明图1是本专利技术制备的原生质体过滤装置，(A)两个相同规格的茶漏；(B)两层300目尼龙网；(C)组装好的原生质体过滤装置(Bar＝1cm)。图2是蓖麻叶片原生质体游离与活力检测，(A)为利用优化后的实验体系(主要实验条件：叶片取材时间为20天，叶片切成0.2mm细丝，酶浓度为16g/LRS和8g/LR-10，酶解时间为80min，离心转速为700rpm)所获得的蓖麻叶片原生质体，(B)蓖麻叶片原生质体活力检测效果(40×)。图3是利用优化体系进行蓖麻叶片原生质体转化，Bright：明场；Chloroplastauto-fluorescence：叶绿体自发红光；GFP：绿色荧光蛋白信号；Merged：Chloroplastauto-fluorescence与GFP的叠加。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。实施例中所采用的茶漏：长11.4cm，上口直径6.4cm，底部滤网直径3.3cm，高2.7cm，120目过滤网。以下实施例中所采用的材料及方法：1.主要试剂的配制(1)MS基本培养基：无机成分(16.5g/L硝酸铵、19g/L硝酸钾、1.7g/L磷酸二氢钾、3.7g/L七水硫酸镁、4.4g/L二水氯化钙、16.9mg/L一水硫酸锰、8.6mg/L七水硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.25mg/L二水硫酸钼二钠、0.02本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.利用完整的种子幼胚培养蓖麻无菌苗，培养20天后，取叶片并吸干表面水分，舍去主叶脉部分，把叶片切成0.2mm宽细丝，然后将其浸没于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振荡酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纤维素酶RS、8g/L的离析酶R‑10、0.5M的甘露醇、20mM MES、10mM CaCl2和1g/L的BSA，余量为水；b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的叶片细丝，收集漂洗后的溶液，利用原生质体过滤装置过滤，收集过滤液，700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心10min，去上清，沉淀即为蓖麻原生质体。

【技术特征摘要】
1.一种蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.利用完整的种子幼胚培养蓖麻无菌苗，培养20天后，取叶片并吸干表面水分，舍去主叶脉部分，把叶片切成0.2mm宽细丝，然后将其浸没于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振荡酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纤维素酶RS、8g/L的离析酶R-10、0.5M的甘露醇、20mMMES、10mMCaCl2和1g/L的BSA，余量为水；b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的叶片细丝，收集漂洗后的溶液，利用原生质体过滤装置过滤，收集过滤液，700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心10min，去上清，沉淀即为蓖麻原生质体。2.根据权利要求1所述的蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，所述的无菌苗的培养方法为：挑取成熟饱满的蓖麻种子于蒸馏水中浸泡一天，剥去外壳，使用75体积分数％的乙醇水溶液浸泡1min，再使用质量分数2％的次氯酸钠浸泡并震荡10-15min，最后使用蒸馏水冲洗3-5次后，用无菌镊子剥离蓖麻完整的幼胚接种于MS基本培养基上，25±1℃、光照强度为2000lx、光照12h/黑暗12h的条件下培养。3.根据权利要求1所述的蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，所述的W5溶液含有2mMMES、154mMNaCl、125mMCaCl2和5mMKCl，余量为水。4.根据权利要求1所述的蓖麻原生质体制备方法，其特征在于，所述的制备得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘颖，桑毅，胡汉桥，张力，张龙军，劳永志，詹军强，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东,44