一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用，属于微生物领域。所述产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017811。所述方法包括：1)在酵素源材料中经过分离和纯化后得到多个乳酸菌，所述酵素源材料由新谷酵素株式会社生产；2)筛选步骤1)所得的所述乳酸菌，得到所述产细菌素的凝结芽孢杆菌。该产细菌素的凝结芽孢杆菌可以应用于食品领域，同时，该产细菌素的凝结芽孢杆菌能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，在酸性及中性条件下均具有良好的抑菌效果，同时，具有良好的热稳定性。

Bacillus coagulant producing bacteriocin and its preparation method and Application

The invention discloses a Bacillus coagulant producing bacteriocin and a preparation method and application thereof, belonging to the field of microorganisms. The bacteriocin-producing Bacillus coagulans was preserved in China Typical Culture Preservation Center on December 19, 2017, and the preservation number was CCTCC NO: M 2017811. The methods include: 1) a plurality of lactic acid bacteria are obtained after separation and purification in the enzyme source material, the enzyme source material is produced by the new cereal enzyme plant; 2) the screening step 1) of the lactic acid bacteria obtained from the bacteriocin producing Bacillus coagulant. Bacillus coagulants producing bacteriocin can be used in food field. At the same time, Bacillus coagulants producing bacteriocin can inhibit Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, and have good bacteriostasis effect under acidic and neutral conditions. At the same time, it has good thermal stability.

【技术实现步骤摘要】
一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及微生物领域，特别涉及一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用。
技术介绍
细菌素(Bacteriocin)是细菌在代谢过程中由核糖体合成的。细菌素是由基因编码的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质。细菌素具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物相容性等优点，使其作为绿色生物防腐剂在农产品和其它食品的保藏和农作物安全生产中倍受关注。考虑到细菌素产生菌的产量及细菌素的安全性，到目前为止，只有乳酸菌产生的细菌素可作为绿色防腐剂应用于食品行业。乳酸菌在其代谢过程中能够产生乳酸、乙酸等有机酸，这些化学物质能抑制其它微生物的生长，很多乳酸菌还能产生蛋白质或肽类抑菌物质细菌素。和目前市场上广泛使用的食品级防腐剂(例如：苯甲酸和山梨酸)相比，乳酸菌产生的细菌素具有易分解、无残留、无抗性、无毒副作用等优点。目前已经发现的乳酸链球菌素(Nisin)被批准应用于食品中，并实现了工业化生产。由于乳酸链球菌素仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且在中性条件下抑菌性差，热稳定性差，这限制了乳酸链球菌素在食品防腐保鲜中的应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中的乳酸链球菌素仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且在中性及碱性条件下抑菌性差、稳定性差的问题，本专利技术实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌及其制备方法和应用。所述技术方案如下：一方面，本专利技术实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017811。具体地，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌的16SrDNA的序列如序列表中SEQIDNO:1所示。另一方面，本专利技术实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌的制备方法，所述制备方法包括：1)将酵素源材料经过分离和纯化后得到多个乳酸菌，所述酵素源材料由新谷酵素株式会社生产；2)筛选步骤1)所得的所述乳酸菌，得到所述产细菌素的凝结芽孢杆菌。具体地，所述分离和纯化的方法包括：将所述酵素源材料与无菌水按照1:100的质量比进行混合，得到混合液；将所述混合液进行梯度稀释，得到浓度不同的稀释液；将所述浓度不同的稀释液分别在第一乳酸细菌固体培养基上培养，得到多个待纯化的乳酸菌；将所述多个待纯化的乳酸菌在第二乳酸细菌固体培养基上培养，得到多个纯化的乳酸菌。进一步地，所述稀释液的浓度分别为：10-4mg/L、10-5mg/L、10-6mg/L和10-7mg/L。进一步地，将带有所述稀释液的所述第一乳酸细菌固体培养基于30～40℃培养20～24h。优选地，37℃培养24h。进一步地，将带有所述多个待纯化的乳酸菌的第二乳酸细菌固体培养基于30～40℃培养20～24h。优选地，37℃培养24h。进一步地，所述筛选的方法包括：将所述多个纯化的乳酸菌接种于乳酸细菌液体培养基中于30～40℃无氧条件下静置培养12～18h；得到发酵液；优选地，37℃培养18h。在4℃下，将所述发酵液离心后，得到上清液；将所述上清液通过牛津杯法筛选出所述产细菌素的凝结芽孢杆菌。更进一步地，所述发酵液于10000r/min下离心20min后，得到所述上清液。再一方面，本专利技术实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌的应用，所述应用包括：将所述产细菌素的凝结芽孢杆菌作为食品防腐剂应用于食品行业。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供了一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，该产细菌素的凝结芽孢杆菌由酵素源材料经过分离纯化和筛选后得到，该酵素源材料为食品，这使得该产细菌素的凝结芽孢杆菌可以应用于食品领域，同时，该产细菌素的凝结芽孢杆菌能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中对常见的几种食源性致病菌如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果十分明显，对沙门氏菌也有一定程度抑制作用，这说明凝结芽孢杆菌的抑菌产物具有广谱抗菌作用，同时，具有良好的热稳定性，在酸性及中性条件下均具有良好的抑菌效果。该产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武汉、武汉大学，该凝结芽孢杆菌分类命名分别为：BacilluscoagulansTK1，保藏编号为CCTCCNO:M2017811。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供乳酸菌TK1和乳酸菌L32以金黄色葡萄球菌作为指示菌的抑菌结果图，图中，左侧的牛津杯中为乳酸菌L32，右侧的牛津杯中为乳酸菌TK1；图2是本专利技术实施例提供乳酸菌TK1和乳酸菌L32以大肠杆菌K99作为指示菌的抑菌结果图，图中，左侧的牛津杯中为乳酸菌TK1，右侧的牛津杯中为乳酸菌L32；图3是本专利技术实施例提供乳酸菌TK1和乳酸菌L32以沙门氏菌作为指示菌的抑菌结果图，图中，左侧的牛津杯中为乳酸菌L32，右侧的牛津杯中为乳酸菌TK1；图4是本专利技术实施例提供产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的16SrDNA片段的电泳图；图5是本专利技术实施例提供的产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的生长曲线图；图6是本专利技术实施例提供的酸抑制作用的排除试验结果图，图中1为乳酸，2为乙酸，3为产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1；图7为过氧化氢排除试验结果图，图中左侧为产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的发酵液，右侧为经过氧化氢酶处理的产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的发酵液；图8是本专利技术实施例提供的蛋白酶消化试验结果图，图中4含有胃蛋白酶，5含有胰蛋白酶，6含有蛋白酶K；图9是本专利技术实施例提供的热稳定性试验结果图，图中左侧为经100℃加热10分钟处理后的凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液，右侧为未经处理的凝结芽孢杆菌的发酵上清液；图10是本专利技术实施例提供的乳酸链球菌素和产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的抑菌圈试验结果图，图中左侧为乳酸链球菌素的抑菌圈，右侧为产细菌素的凝结芽孢杆菌TK1的抑菌圈；图11是本专利技术实施例提供的凝结芽孢杆菌TK1，图中左侧为凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液，右侧为将pH值调节至7后的凝结芽孢杆菌TK1的发酵上清液。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。本专利技术实施例提供的试剂均购于武汉勤洁生物有限公司。本专利技术实施例提供了一种制备产细菌素的凝结芽孢杆菌的方法，该方法包括：1)将酵素源材料经过分离和纯化后得到2种乳酸菌，分别命名为TK1和L32，酵素源材料由新谷酵素株式会社生产，且酵素源材料的生产批号为：4560264290396；具体地，分离和纯化的方法包括：在无菌条件下，将酵素源材料剪成小块后装入试管中，向试管中加入适量无菌水，其中，酵素源材料与无菌水按照1:100的质量比进行混合，待其充分溶解后得到混合液；吸取0.1mL混合液进行梯度稀释，得到终浓度分别为：10-4mg/L、10-5mg/L、10-6mg/L和10-7mg/L的稀释液。取上述四种浓度不同的稀释液各0.2mL分别均匀涂布在四个第一乳酸细菌固体培养基的表面，并于30～40℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017811。

【技术特征摘要】
1.一种产细菌素的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017811。2.根据权利要求1所述的产细菌素的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述产细菌素的凝结芽孢杆菌的16SrDNA的序列如序列表中SEQIDNO:1所示。3.一种产细菌素的凝结芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：1)将酵素源材料经过分离和纯化后得到多个乳酸菌，所述酵素源材料由新谷酵素株式会社生产；2)筛选步骤1)所得的所述乳酸菌，得到所述产细菌素的凝结芽孢杆菌。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分离和纯化的方法包括：将所述酵素源材料与无菌水按照1:100的质量比进行混合，得到混合液；将所述混合液进行梯度稀释，得到浓度不同的稀释液；将所述浓度不同的稀释液分别在第一乳酸细菌固体培养基上培养，得到多个待纯化的乳酸菌；将所述多个待纯化的乳酸菌在第二乳酸细菌固体培养基上培养，得到多个纯化的乳酸菌。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖运才，师帅，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42