融合猪抗菌肽FPAP重组酵母菌制剂的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了融合猪抗菌肽FPAP重组酵母菌制剂的制备及应用。本发明专利技术所提供的融合蛋白，包括猪抗菌肽PR‑39、猪抗菌肽Tritrpticin、猪抗菌肽PAMP23和猪抗菌肽PG1；所述猪抗菌肽PR‑39、猪抗菌肽Tritrpticin、猪抗菌肽PAMP23和猪抗菌肽PG1的氨基酸序列分别为序列1第1‑42位、序列1第51‑63位、序列1第72‑94位和序列1第103‑129位。实验证明，本发明专利技术的FPAP可以促进淋巴细胞、红细胞和白细胞的增殖，抑制致病微生物的生长，促进非特异性抗体(IgG、IgG1、IgG2a)及疾病特异抗体的分泌，提高动物的免疫能力与存活率。

Preparation and application of recombinant yeast preparation incorporating pig antibacterial peptide FPAP

The invention discloses a preparation and application of a recombinant yeast preparation integrating pig antibacterial peptide FPAP. The fusion protein provided by the present invention includes the pig antibacterial peptide PR 39, the pig antibacterial peptide Tritrpticin, the pig antibacterial peptide PAMP23 and the porcine antibacterial peptide PG1, and the amino acid sequences of the porcine antibacterial peptide PR 39, the porcine antibacterial peptide Tritrpticin, the porcine antibacterial peptide PAMP23 and the pig antibacterial peptide PG1 respectively are sequence 1 first, sequence 1 fifty-first, 63, sequence 1, respectively. Seventy-second 94 bits and 129 sequences of 1 103rd. The experiment shows that the FPAP can promote the proliferation of lymphocyte, red blood cell and leukocyte, inhibit the growth of pathogenic microorganism, promote the secretion of non specific antibody (IgG, IgG1, IgG2a) and disease specific antibody, and improve the immune ability and survival rate of animals.

【技术实现步骤摘要】
融合猪抗菌肽FPAP重组酵母菌制剂的制备及应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种融合猪抗菌肽FPAP重组酵母菌制剂的制备及应用。
技术介绍
现在限制我国养殖业进一步发展和提高经济效益的主要问题是动物疾病的控制、动物产品质量提高和优质廉价饲料的开发生产。我国出口动物产品因检疫和药残质量较低，出口所占比例很低，如猪肉为23万多吨，仅占国际贸易量的4％左右。尤其是四川动物饲料的豆粕等蛋白质原料的90％和玉米等能量饲料原料的70％均依赖外部供给，这就严重制约了我省的畜牧业生产发展和经济效益的提高。因此，如何利用高新生物技术开发高效特色生物饲料，充分利用本地饲料资源，减少饲料中抗生类素添加剂的使用，克服动物产品的药残危害，保障绿色有机动物食品的生产，保护人民群众生命健康安全，已成为当代亟需解决的重大科技和社会经济难题。目前中国畜禽养殖业随着集约化程度提高，畜禽养殖规模和养殖密度日益扩大，迫于控制30多种传染性病原感染传播扩散的压力，尤其是禽流感和呼吸繁殖综合症等烈性病相继循环爆发，动物养殖中耐药菌引起的腹泻，沙门、大肠杆菌、链球菌、蓝耳病(PRRSV)、圆环病毒(PCV2)、猪瘟(CSFV)等各种细菌、病毒性疾病，长期以来是畜牧养殖中瓶颈限制问题，严重阻碍畜牧业的发展；使抗生素等药物添加剂在饲料的滥用情况非常严重，畜禽疾病和抗生素饲料添加剂的公害问题已经成为制约我国畜禽养殖业发展水平和经济效益提高的瓶颈。饲料抗生素添加剂的滥用不仅提高饲养成本，也导致病原微生物的耐药性和致病力明显增强，严重破坏了动物消化道的微生态平衡，长期使用后在动物体内残留、并富集，畜禽机体因药物毒副作用而削弱健康水平，免疫抗病力显著下降。如此恶性循环，畜禽各种烈性传染疾病频繁发生，难于控制和治疗。而另一方面，药物残留及日益严重的畜禽产品食品安全问题，不仅直接威胁着人类自身的健康，也阻碍了养殖业的发展。动物饲料添加抗生素，长期或不适当使用不仅将诱导病菌出现抗药性，而且在动物产品出现药物残留，造成严重的食品安全隐患，损害人类健康以及招致治疗抗生素的药物失效。欧盟、美国等发达地区2006年开始全面限制抗生素作为饲料添加剂。我国也将严格限制饲料添加抗生素。现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。抗菌肽分子量小，分离纯化和检验存在一定的困难。目前科研中抗菌肽的主要来源是化学合成，但化学合成成本高，量小，不利于大规模应用。所以，我们利用基因工程手段，重组连接多个抗菌肽基因，获得具有广谱抗多种微生物(G+、G-、病毒、真菌、寄生虫)和免疫调节活性的高效重组抗菌肽分子。有关抗菌肽基因与其它相关基因融合克隆和表达的报道也逐渐增多，但很少见有关将多种均有抗菌活性的短肽基因融合，并在共表达后形成多个活性分子而协同抗菌抗感染提高免疫水平的报道。本专利技术通过基因重组融合，构建新的具有抗细菌、病毒、真菌及寄生虫和免疫调节等多种活性的融合抗菌肽基因(PR-39/Tritrpticin/PAMP23/PG1cDNA，)，将其连接到真核酵母表达技术获得融合蛋白，进一步通过相对MIC法研究融合蛋白的免疫调节活性及其抗菌、抗病毒活性，以获得广谱高效抗微生物以及免疫调节作用强的重组蛋白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何提高动物的免疫能力。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种蛋白质，名称为FPAP，包括4种猪抗菌肽；所述4种猪抗菌肽的氨基酸序列分别为序列1第1-42位、序列1第51-63位、序列1第72-94位和序列1第103-129位。上述蛋白质为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。编码上述蛋白的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列2；2)其编码序列为序列表中序列2；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码上述蛋白的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列2编码序列1所示的FPAP。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码FPAP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的FPAP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码FPAP且具有FPAP功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。下述1)-3)中的任一种生物材料也是本专利技术保护的范围：1)含有上述核酸分子的表达盒；2)含有上述核酸分子的重组载体；3)含有上述核酸分子的重组菌或转基因细胞系；4)所述重组菌的发酵产物。上述应用中，B2)所述的含有编码FPAP的核酸分子的表达盒(FPAP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达FPAP的DNA，该DNA不但可包括启动FPAP基因转录的启动子，还可包括终止FPAP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的载体构建含有所述FPAP基因表达盒的重组载体。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pGAPZαA载体。B3)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码FPAP的DNA序列。进一步所述重组载体具体可为pG-p。所述pG-p为将pGAPZαA载体的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的FPAP基因，得到的重组载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为毕赤酵母SMD1168。上述应用中，所述重组微生物可为将含有编码FPAP的核酸分子的表达盒导入酵母中得到的重组微生物。所述重组微生物具体可为将含有FPAP表达盒的重组载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，包括猪抗菌肽PR‑39、猪抗菌肽Tritrpticin、猪抗菌肽PAMP23和猪抗菌肽PG1；所述猪抗菌肽PR‑39、猪抗菌肽Tritrpticin、猪抗菌肽PAMP23和猪抗菌肽PG1的氨基酸序列分别为序列1第1‑42位、序列1第51‑63位、序列1第72‑94位和序列1第103‑129位。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，包括猪抗菌肽PR-39、猪抗菌肽Tritrpticin、猪抗菌肽PAMP23和猪抗菌肽PG1；所述猪抗菌肽PR-39、猪抗菌肽Tritrpticin、猪抗菌肽PAMP23和猪抗菌肽PG1的氨基酸序列分别为序列1第1-42位、序列1第51-63位、序列1第72-94位和序列1第103-129位。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有提高动物免疫能力功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。3.编码权利要求1或2所述蛋白的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列2；2)其编码序列为序列表中序列2；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。5.下述1)-4)中的任一种生物材料：1)含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：高荣，万小平，魏泓，肖永乐，吴雪颖，朱玉华，胡立博，刘建华，田玉虎，吕学斌，王泽洲，李江淩，
申请(专利权)人：深圳市前海金卓生物技术有限公司，四川大学，
类型：发明
国别省市：广东,44