一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法技术

本发明专利技术涉及一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法，包括以下步骤：(1)向鲜猪粪中加入碎麦秆、粉碎的废菌棒、草木灰、锯末，混合均匀；(2)将步骤(1)加料后的猪粪密封，进行厌氧堆肥化处理，堆肥化处理时间为20d～25d、温度为40℃～50℃、含水率为50％～65％、pH值为7.0～8.0。本发明专利技术可以明显削减抗性基因丰度和抗生素含量。而且方法简单、所用材料成本低廉，便于控制，适合大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法
本专利技术涉及一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法。
技术介绍
畜禽粪便是优质有机肥，但随着抗生素在畜禽养殖中的广泛应用，畜禽粪便已成为抗生素和抗性基因的重要富集位点，其未经处理直接施用具有潜在的生态环境和人类健康风险。抗生素抗性基因(ARGs)是一种新型环境污染物，它们在环境中的持久性残留、传播和扩散比抗生素本身的危害还要大。世界卫生组织将ARGs作为21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一。研究表明，养殖场排放的猪粪以及养猪场附近的土壤与水源均受到猪粪的影响，能检测到高浓度ARGs。我们也检测到浙江温州地区养殖场猪粪中的ARGs、抗生素与重金属含量均较高(检测到猪粪中抗性基因种类至少有100多种)，对附近土壤及水源具有产生复合污染的潜在风险。另有研究表明，抗生素与重金属的复合污染会促进诱发抗性基因；垂直转移(抗性基因的宿主菌落演替影响传播)与水平转移(通过可移动遗传元件进行菌间传播)是环境中抗性基因的两种重要传播途径。因此，很有必要开展猪粪的ARGs控制与削减技术研究。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法。本专利技术所采取的技术方案如下：一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法，包括以下步骤：(1)向鲜猪粪中加入碎麦秆、粉碎的废菌棒、草木灰、锯末，混合均匀；(2)将步骤(1)加料后的猪粪密封，进行厌氧堆肥化处理，堆肥化处理时间为20d～25d、温度为40℃～50℃、含水率为50％～65％、pH值为7.0～8.0。优选地，步骤(1)中，V鲜猪粪︰V碎麦秆＝5.5-6.5︰3.5-4.5，粉碎的废菌棒相比干猪粪的质量比为8.5-9.1％，草木灰相比干猪粪的质量比为12.2-12.8％，锯末相比干猪粪的质量比为6.5-7.3％。优选地，步骤(2)中，将步骤(1)加料后的猪粪贮存于无菌透明塑料膜下密封，堆放在配备有辅助加温系统的温室大棚中进行厌氧堆肥化处理。优选地，第7天和第14天各翻堆一次。优选地，期间用无机调理剂石灰、氯化铁调节pH值使其保持在7.0～8.0。本专利技术的有益效果如下：本专利技术可以明显削减抗性基因丰度和抗生素含量。而且方法简单、所用材料成本低廉，便于控制，适合大范围推广应用。具体实施方式实施例1：设置堆肥化处理时间(20d～25d)、温度(40℃～50℃)、含水率(50％～65％)与pH值(7.0～8.0)。对收集的猪粪进行处理：向鲜猪粪中加入碎麦秆(V鲜猪粪︰V麦秆＝6︰4)和与干猪粪的质量比为8.8％的粉碎的废菌棒，再加入与干猪粪的质量比为12.5％的草木灰和与干猪粪的质量比为6.9％的锯末。然后，将经过上述方案处理的猪粪贮存于无菌透明塑料膜下密封，堆放在温室大棚(配备有辅助加温系统)中进行厌氧堆肥化处理。开始的15d，每7d翻堆1次。期间，用温室大棚(配备有辅助加温系统)控制温度，用无机调理剂石灰、氯化铁调节pH值，通过添加碎麦秆调节含水率。实施例2：设置堆肥化处理时间(20d～25d)、含水率(50％～65％)与pH值(7.0～8.0)。对收集的猪粪进行处理：向鲜猪粪中加入碎麦秆(V鲜猪粪︰V麦秆＝6︰4)和与干猪粪的质量比为8.8％的粉碎的废菌棒，再加入与干猪粪的质量比为12.5％的草木灰和与干猪粪的质量比为6.9％的锯末。然后，将经过上述方案处理的猪粪贮存于无菌透明塑料膜下密封，堆放常温室外中进行厌氧堆肥化处理。开始的15d，每7d翻堆1次。期间，用无机调理剂石灰、氯化铁调节pH值，通过添加碎麦秆调节含水率。实施例3：设置堆肥化处理时间(20d～25d)、温度(40℃～50℃)、含水率(50％～65％)与pH值(7.0～8.0)。对收集的猪粪进行处理：向鲜猪粪中加入碎麦秆(V鲜猪粪︰V麦秆＝6︰4)。然后，将经过上述方案处理的猪粪贮存于无菌透明塑料膜下密封，堆放在温室大棚(配备有辅助加温系统)中进行厌氧堆肥化处理。开始的15d，每7d翻堆1次。期间，用温室大棚(配备有辅助加温系统)控制温度，用无机调理剂石灰、氯化铁调节pH值，通过添加碎麦秆调节含水率。将以上各实施例采集猪粪样品，每次采样均做三个重复，并储存在-80℃。通过以下方式进行检测抗性基因丰度和抗生素含量。一、检测抗性基因丰度DNA提取样品DNA的提取，采用基于SDS的低温研磨抽提方法，用低熔琼脂糖凝胶加上苯酚提取的方法进行纯化。用1.2％琼脂糖凝胶电泳和分光光度计分析DNA的质量和浓度。引物设计采用295个有效引物组，包括285个ARGs(含ARGs的所有主要种类)，9个转座酶基因和1个16SrRNA基因。定量PCR采用WafergenSmartChipReal-timePCR系统完成所有高通量qPCR反应(委托上海启因生物科技有限公司完成)。SmartChipnanowell平台能够用来进行大规模的基因表达研究，其每转能够进行5,184次nanowell反应。依据WafergenBiosystems提供的标准达到质量保证/质量控制(QA/QC)。PCR混合液(100nl/孔)成分：1×LightCycler480SYBRGreenIMaster(RocheAppliedSciences,Indianapolis,IN)，1mg/mL的牛血清白蛋白，各引物(500nM)和DNA模板(5ng/μL)。以296(assays)×16个样品的模式，采用SmartChipMultisampleNanodispenser(MSND)将PCR混合液分配到芯片(5184孔)，然后用SmartChip循环仪进行实时定量PCR(qPCR)。每个芯片上的每一引物组设置一个无模板的对照。95℃下酶活化10min，然后进行40个循环的扩增：95℃变性30s，60℃退火30s。熔化过程由Wafergen软件自动产生。用SmartChipqPCR软件(v2.7.0.1)分析qPCR的结果，放弃有多熔融峰的孔以及扩增效率超过范围(1.8-2.2)的孔。所有qPCR反应进行3个重复，阈值循环(Ct)31用作检测极限。只有那些有3个或4个重复，且经过扩增的样品被认为是阳性。在计算参照样品的ΔCt时，如无扩增，则使用检测极限Ct(31)。如果由平均倍数变化的双标准差所产生的范围完全＞1，在统计上即认为基因增加了。二、抗生素的测定以养殖业中使用量较大的典型抗生素为检测对象，包括四环素、土霉素、多霉素、诺氟沙星、环丙沙星、青霉素、头孢菌素、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、泰乐菌素、红霉素。试剂与设备甲醇(色谱纯)和甲酸(分析纯)从德国Merck公司购置；柠檬酸、磷酸氢二钠和乙二胺四乙酸二钠(分析纯)从国药集团化学试剂有限公司(上海)购置；实验用水为Milliport超纯水仪制备。抗生素从德国Dr公司与中国药品生物制品检定所购置。EDTA-Mcllvaine缓冲液配制：称取柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠27.5g，乙二胺四乙酸二钠37.2g溶于水中并定容到1L(pH＝4.0)。分别称取各抗生素(0.0500±0.0005)g于相应50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到1000.0mg·L-1的标准储备液备用。抗生素的混合标准溶液由上述标准储备液用甲醇混合稀释制备。样品采集分别在对照组与各处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向鲜猪粪中加入碎麦秆、粉碎的废菌棒、草木灰、锯末，混合均匀；(2)将步骤(1)加料后的猪粪密封，进行厌氧堆肥化处理，堆肥化处理时间为20d～25d、温度为40℃～50℃、含水率为50％～65％、pH值为7.0～8.0。

【技术特征摘要】
1.一种治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向鲜猪粪中加入碎麦秆、粉碎的废菌棒、草木灰、锯末，混合均匀；(2)将步骤(1)加料后的猪粪密封，进行厌氧堆肥化处理，堆肥化处理时间为20d～25d、温度为40℃～50℃、含水率为50％～65％、pH值为7.0～8.0。2.根据权利要求1所述的治理猪粪中抗性基因、抗生素的方法，其特征在于：步骤(1)中，V鲜猪粪︰V碎麦秆＝5.5-6.5︰3.5-4.5，粉碎的废菌棒相比干猪粪的质量比为8.5-9.1％，草木灰相比干猪粪的...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢晓明，张辉，
申请(专利权)人：温州科技职业学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33