一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用技术

一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用，该干细胞复合体由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部，还包括一端伸出胶原蛋白凝胶表面的可吸收缝合线。本发明专利技术的干细胞复合体中，干细胞在诱导分化条件下可以定向分化为类似于器官组织的前体干细胞系，这种方法过模拟了毛囊发育的上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用的过程，移植后能够产生功能完整的毛发，使干细胞移植更类似于组织器官移植。

Stem cell complex for inducing hair regeneration, preparation method and application thereof

A stem cell complex that induces hair regeneration, its preparation method and its application. The stem cell complex consists of a cell culture scaffold and a stem cell. The main body of the cell culture scaffold is a collagen gel droplet, the stem cells are placed inside the collagen gel droplet, and one end extends the surface of the collagen gel. Absorbable suture. In the stem cell complex of the present invention, the stem cells can differentiate into a precursor stem cell line similar to organ tissue in the induced differentiation condition. This method simulates the process of interaction between the epithelial cells and mesenchymal cells developed by the hair follicle, and can produce complete functional hair after transplantation, and make the stem cells move. Transplantation is more similar to tissue organ transplantation.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用
本专利技术属于干细胞领域，具体涉及一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用。
技术介绍
毛发的存在是哺乳动物的特征，其所承担的作用十分广泛，包括物理防护、隔热、掩护、分散汗液和脂肪、感觉和触觉功能以及社会意义上的相互作用。健康成人头发总数平均有5～15万根，其生长受年龄、气候、环境及健康状况等多种因素影响，但调控毛发周期性生长的主要结构为毛囊细胞。毛囊呈周期性、有规律地自我再生，在人体内终生不断。但是，因雄激素退化或突变、斑秃发、脂溢性皮、外伤等会造成秃发，即指长毛部位的毛发出现脱落、变小、退化或脆性增加。秃发在世界范围内有很高的患病率，在我国男性的患病率为21.3％，女性患病率为6.0％。在人类精神社会中毛发有着不可替代的重要性，秃发会给患者产生非常严重的精神、心理、人格问题，而且，随着现代人对自身形象更加关注，对科研工作者们提出了毛发再生这一亟待解决的难题。目前，针对于毛发脱失的治疗主要有药物治疗和手术治疗。药物治疗仅能延缓秃发的过程，无法从根本上解决秃发的困扰。而手术治疗以自体毛发移植为主，虽然从某种程度上解决了秃发的外观，但由于无法再生出新的毛囊，对于供区不足的患者难于实施。由此，不少学者致力于毛发再生方面的研究，并取得了一定的进展。目前，毛发再生的研究主要围绕如何通过调控毛囊干细胞的增殖分化而进行毛囊干细胞移植。1990年Cotsarelis等人在毛囊隆突部发现毛囊干细胞，而随后科研人员分离单个毛囊干细胞就可以体外大量增殖，并能够在体内分化为表皮、皮脂腺和毛囊，所以，毛囊干细胞是治疗大面积皮肤损伤、秃发的重要种子细胞。因此，毛囊干细胞为皮肤再生研究提供了一个新的思考方向，为治疗秃发提供了非常可观的医学应用前景。最初临床上将毛囊单株或毛囊单位进行毛囊移植，但这种方法需分离自体头皮毛囊，操作复杂繁琐，而且无法再生新的毛囊，对于供区不足的患者难以实施。而随着胞培养技术和组织工程技术的发展，以毛囊干细胞再生为理论基础而设计的毛囊干细胞的三维培养体系已经得到进一步完善。但是，研究发现，毛囊干细胞移植后虽然能够形成毛囊类似物，但毛干不能长出皮肤表，而且体外长时间培养易失去诱导毛囊形成的能力。这是因为毛发再生并非是单一胚层单一种类细胞的再生，毛发再生是毛发生长区域内的表皮和间充质组织相互作用、支持的结果，涉及到多胚层细胞的再生问题。毛囊主要由上皮和真皮两部分结构组成，毛囊干细胞位于上皮部的隆突部，而间充质干细胞位于真皮乳头部，两种干细胞对于毛发再生均有着重要的作用。毛发的再生需要与周围组织如血管、汗腺、竖毛肌、结缔组织等发生功能联系才能发育成熟，故单纯的毛囊干细胞移植不能产生全能的毛发，即毛囊可以成功与周围组织发生功能联系并维持理想的毛发生长周期。此外目前的干细胞和三维组织工程的方法主要围绕改善干细胞生存微环境、提高干细胞的存活率和调控定向转化而展开的，但仍无法避免移植后的致瘤问题。其产生的主要原因是移植后存在未分化的干细胞，而移植受体组织内干细胞的增殖和分化的失控可导致畸胎瘤的产生。而且，干细胞移植后其组织发生顺序及解剖位置并没有具体引导信号参与。如果将这种胚胎干细胞在体外自发分化后获得的细胞不经过任何筛选，直接移植入动物体内，结果将不可避免地产生畸胎瘤。虽然可以通过流式细胞技术去处未分化细胞，但是目前仍缺乏特异性非常高的细胞标记分子，而且筛选效率不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用，该干细胞复合体具有能够模拟表皮层与真皮层细胞相互作用诱导毛发再生的生理过程的特点，可以产生类似于皮肤毛发器官的毛囊干细胞系，移植后可以产生功能完整的毛发。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种诱导毛发再生的干细胞复合体，其由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部；可吸收缝合线埋于胶原蛋白凝胶悬滴内部，贯穿于干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面。进一步，所述干细胞至少有两种，其在胶原蛋白凝胶悬滴内部形成表皮分化层和真皮分化层，其中，表皮分化层位于真皮分化层上层，表皮分化层与真皮分化层中的干细胞密度比例为1：2～4。进一步，形成表皮分化层的干细胞选自人毛囊干细胞或表皮干细胞，形成真皮分化层的干细胞选自间充质干细胞。又，所述干细胞是以拟胚体形式存在的，30～48个拟胚体单位接种于胶原蛋白凝胶悬滴中。优选地，所述胶原蛋白凝胶悬滴的制备过程为：将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1-1.5：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH0.075-0.085mol/L和HEPES180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/ml，pH3.0-3.5。本专利技术所述诱导毛发再生的干细胞复合体的制备方法，包括如下步骤：1)制作细胞培养支架将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH0.075-0.085mol/L和HEPES180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/ml，pH3.0-3.5；2)组装干细胞将干细胞悬浮液或者拟胚体置入胶原蛋白凝胶悬滴内，操作完成后再将含干细胞悬浮液或者拟胚体的胶原蛋白凝胶悬滴孵育15-20min，完成干细胞的组装；3)插入可吸收缝合线将长度5-8mm的可吸收缝合线插入胶原蛋白凝胶悬滴中，贯穿干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面，获得所述诱导毛发再生的干细胞复合体。所述干细胞复合体应用在诱导毛发再生中。进一步，将所述干细胞复合体在培养基中诱导分化培养，其中，所述培养基中含有：DMEM/F12培养基，去血清置换液，L-谷氨酸2mM，非必需氨基酸0.1mM、β-巯基乙醇0.1mM、青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml、bFGF10-15ngmg/ml，其中，DMEM/F12培养基和去血清置换液的体积比为80-90：10-20。进一步，所述诱导分化步骤中，诱导分化培养时间为21天，每天更换培养基，培养基中添加生长因子的方案如下：第1天，加入TGF-β245-55ng/ml；第2天，加入RA1-1.5ng/ml；第3天，更换新鲜培养基后加入RA1-1.5ng/ml、TGF-β245-55ng/ml、EGF15-25ng/ml，腺苷25-35mg/ml；第6天，更换新鲜培养基后加入Wint10b450-550ng/ml、Wint3a90-110ng/ml、腺苷25-35mg/ml和PFI-32-2.5mmol/L；第10-21天，更换新鲜培养基后加入Wint10b500-600ng/ml、Wint3a100-120ng/ml和腺苷25-35mg/ml。本专利技术的干细胞复合体中，可由两种以上干细胞构成表皮分化层和真皮分化层，其中，表皮干细胞或者毛囊干细胞构成表皮分化层，间充质干细胞构成真皮分化层，在细胞支架内进行组装，参考图1，这种形式可以模拟毛囊发育过程中表皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导毛发再生的干细胞复合体，其由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部；可吸收缝合线埋于胶原蛋白凝胶悬滴内部，贯穿于干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面。

【技术特征摘要】
1.一种诱导毛发再生的干细胞复合体，其由细胞培养支架和干细胞组成，所述细胞培养支架的主体为胶原蛋白凝胶悬滴，干细胞置于胶原蛋白凝胶悬滴内部；可吸收缝合线埋于胶原蛋白凝胶悬滴内部，贯穿于干细胞间，一端伸出胶原蛋白凝胶表面。2.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述干细胞至少有两种，其在胶原蛋白凝胶悬滴内部形成表皮分化层和真皮分化层，其中，表皮分化层位于真皮分化层上层，表皮分化层与真皮分化层中的干细胞密度比例为1：2～4。3.根据权利要求2所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，形成表皮分化层的干细胞为人毛囊干细胞或表皮干细胞。4.根据权利要求2所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，形成真皮层的干细胞选自间充质干细胞。5.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述干细胞是以拟胚体形式存在的，30～48个拟胚体单位接种于胶原蛋白凝胶悬滴中。6.根据权利要求1所述诱导毛发再生的干细胞复合体，其特征在于，所述胶原蛋白凝胶悬滴的制备过程为：将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1-1.5：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH0.075-0.085mol/L和HEPES180-220mmol/L，所述酸性胶原蛋白浓度为2-3.5mg/ml，pH3.0-3.5。7.如权利要求1或2或5所述诱导毛发再生的干细胞复合体的制备方法，包括如下步骤：1)制作细胞培养支架将α-MEM基质、缓冲液、酸性胶原蛋白以体积比1：1：8-10的比例混合均匀，取30-40μl混合液离心8-10min，再孵育1-1.5h，形成胶状悬滴；其中，所述缓冲液中含有NaOH0.075-0.085mol/L和HEPES...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏乃礼，朱剑虹，王帆，朱侗明，
申请(专利权)人：上海神因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31