一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片制备方法和检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，优化PPV VP2密码子，克隆至pColdI后，转化至大肠杆菌Rossetta 2，进行PPV VP2蛋白的表达。成功表达的VP2蛋白用镍磁珠纯化。将纯化后的PPV VP2蛋白点样到环氧基片，于37℃干燥过夜。次日将芯片表面贴上芯片围栏，每个围栏封闭、洗涤即得。检测时，将封闭后的芯片加入PPV抗体阳性猪血清，洗涤、干燥，加入兔抗猪金标二抗孵育、洗涤、干燥，每个围栏加入银染显色液显色，洗涤后干燥观察结果。本发明专利技术提供的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片可用于实验室检测，也可满足基层养殖场，能够更快速、方便、高通量地检测猪细小病毒抗体的蛋白芯片诊断技术，及时监测猪群细小病毒抗体水平。

Preparation method and detection method of visual protein chip for detection of antibodies against porcine parvovirus

The invention provides a method for the preparation of a visual protein chip for detecting the antibody of porcine parvovirus, and optimizes the PPV VP2 codon. After cloned to pColdI, it is transformed into Escherichia coli Rossetta 2, and the expression of PPV VP2 protein is expressed. The successful expression of VP2 protein was purified with nickel magnetic beads. The purified PPV VP2 protein was dotted onto the epoxy substrate and dried overnight at 37 C. The next day the chip will be pasted on the surface of the chip fence, each fence closed, washed. In the test, the closed chip was added to the PPV antibody positive pig serum, washed and dried, and the Rabbit anti pig gold standard two was added to resist incubation, washing and drying. Every fence was added with silver staining color solution, and the results were observed after washing. The visual protein chip for detection of antibody to porcine parvovirus can be used in laboratory testing, and can also meet the level of protein chip diagnostic technology for detecting porcine parvovirus antibody more quickly, convenient and high throughput, and monitoring the anti body level of porcine parvovirus in time.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片制备方法和检测方法
本专利技术涉及一种生物芯片，尤其涉及一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法和检测方法。
技术介绍
猪细小病毒病(porcineparvovirusinfection，PPI)是由猪细小病毒((porcineparvovirus，PPV)感染所引起的一种猪繁殖障碍病，该病主要表现为：受感染的母猪，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎及弱仔等，但母猪本身无明显的症状。该病广泛存在于世界各地，严重影响养猪业的发展。猪细小病毒感染可以依据临诊症状和流行病学做出初步诊断，一般认为，如果仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、胎儿发育异常等繁殖障碍症状，同时有证据表明是传染性疾病时，应考虑到猪细小病毒感染的可能，但是进一步确诊必须进行实验室诊断。自从首次报道猪细小病毒病以来，国内外学者对该病的诊断方法进行了大量研究，但是各种诊断方法各有利弊。常用于猪细小病毒病诊断的实验室诊断方法有PCR、RT-PCR、QPCR、病毒中和试验、免疫荧光技术、乳胶凝集试验、免疫组化试验、免疫胶体金技术、DNA探针、纳米探针技术等。其中，间接ELISA检测猪细小病毒抗体，是目前临床上常用的一种方法，有市售猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒，也可由实验室自行纯化蛋白并包被至96孔板，建立ELISA检测技术。范朋举等报道中记载，具体为利用大肠杆菌原核表达系统表达猪细小病毒VP2蛋白，经镍柱纯化得到VP2蛋白。将纯化后的VP2蛋白以2-10μg/mL的浓度包被至96孔板，加入100μL100倍稀释的待检血清37℃孵育1h,100μLHRP标记的抗体37℃孵育1h，加100μLTMB底物37℃显色15min，立即用50μL2mol/LH2SO4终止反应。该方法的判定标准为：抗体效价若大于0.18确定为猪细小病毒抗体阳性。但是，ELISA灵敏性相对较低；每个待检样需要200-1000ng蛋白，需要较大量的VP2蛋白；待检血清采集耗费工作量；结果判定需要特定的仪器。蛋白芯片检测技术是近年来在生物科技领域发展起来的一项针对蛋白及多肽等高分子生物的检测技术。作为一种快速、简便、高通量生物芯片分析检测技术，近年来在食品检验、蛋白质组学、疾病诊断、药物筛选、农林畜牧业以及司法鉴定等领域应用日渐增多。蛋白芯片是将各种蛋白质(如抗原、抗体)、多肽以及受体、配体等有序固定于某一载体(如滤膜、凝胶、玻片、纳米微珠和微孔板)之上，以分析检测样品中能与之特异相互作用的成分。但是，生物芯片应用于动物疫病诊断的研究并不广泛。因此，急需建立一种可用于实验室检测，也可满足基层养殖场，用于更快速、方便、高通量地检测猪细小病毒抗体的蛋白芯片诊断技术，及时监测猪群细小病毒抗体水平。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法和检测方法。一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：S1：优化PPVVP2密码子，合成优化的猪细小病毒PPVVP2基因(SEQIDNo.1)；S2：将S1制得的猪细小病毒PPVVP2基因克隆至载体pColdI，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2；S3：将S2制得的阳性克隆pColdI-VP2转化至大肠杆菌Rossetta2，培养转化体，经IPTG诱导，对培养物包涵体洗涤、溶解，用His标签蛋白磁珠纯化后，透析复性、纯化得到重组蛋白PPVVP2，-80℃保存备用；S4：将S3制得的重组蛋白PPVVP2稀释，点样在芯片载体上，所述芯片载体为环氧基片，干燥，封闭，洗涤，制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。过去可视化蛋白芯片的芯片载体常用NC膜、PVDF膜和醛基基片，NC膜和PVDF膜在芯片制备过程中不易固定、洗涤、干燥，并且在操作时易碎或刮花；醛基与寡核苷酸结合能力较强，与蛋白结合能力相对较弱，尽管醛基基片与蛋白质分子结合超过24h也只能结合部分蛋白质或多肽分子。环氧基片与蛋白的结合能力优异，仅需少量PPVVP2蛋白即可制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片，且检测灵敏。另一方面，环氧基片成本相对较低，适合产业化大规模制备和基层购买。进一步的，所述S2中，pColdI质粒和S1合成的PPVVP2基因用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切，酶切产物胶回收纯化，将纯化的酶切产物用T4Ligase连接，于16℃连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，并涂布于氨苄抗性的LA平板，37℃培养过夜，提取质粒，进行双酶切切验证，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2。进一步的，S4中，所述重组蛋白PPVVP2的稀释方法为用2×蛋白芯片点样液稀释，稀释至浓度为0.05-0.4mg/ml，优选的，0.3-0.4mg/ml；所述点样方式为PersonalArrayer16接触式点样系统点制芯片；所述干燥条件为37℃干燥过夜；所述封闭方法为，将干燥的环氧基片表面贴上芯片围栏，每个芯片围栏加入100μL1％BSA，37℃封闭2h；所述洗涤方法为，用PBST洗涤5min。进一步的，S4中，所述制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片保存条件为4℃保存。前述制备的一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：S1：将待测血清稀释后，点样至所述检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的芯片载体上，37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；S2：在S1的点样点上点样或在S1点样所在的芯片围栏中加入100倍稀释的兔抗猪金标二抗于37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；S3：在S2的点样点上或在S2处理所在的的芯片围栏中加入1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色8-15min，用PBST洗涤5min后干燥观察结果。若出现银色斑点则判定为抗体阳性，若无斑点则判定为抗体阴性。进一步的，S1所述待测血清稀释倍数为10-6000倍，优选的，2000倍。进一步的，S1所述待测血清孵育时间为30-45min，S2所述兔抗猪金标二抗孵育时间为60min.进一步的，S3所述显色时间为10min。前述制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片在制备猪细小病毒抗体检测试剂盒中的应用。一种猪细小病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括前述制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。本专利技术技术方案所实现的有益效果为：1、本专利技术建立的可视化蛋白芯片技术应用于检测猪细小病毒抗体，用建立的可视化蛋白芯片技术检测170份未知的临床血清样本，阳性检出率可达80.6％，而商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒检出的阳性率为78.2％，蛋白芯片的阳性检出率比商品化的猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒高出2.4％。因此，蛋白芯片的特异性与灵敏性更高、具有高通量的特点。2、本专利技术采用的环氧基修饰的基片能与PPVVP2蛋白高效结合，相对于可视化蛋白芯片中过去常用NC膜、PVDF膜和醛基基片，环氧基修饰的基片只需要微量PPVVP2蛋白即可制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片，且检测灵敏。另一方面，环氧基片成本相对较低，适合产业化大规模制备和基层购买。相对于ELIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1：优化PPV VP2密码子，合成优化的猪细小病毒PPV VP2基因(SEQ ID No.1)；S2：将S1制得的猪细小病毒PPV VP2基因克隆至载体pColdI，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI‑VP2；S3：将S2制得的阳性克隆pColdI‑VP2转化至大肠杆菌Rossetta 2，培养转化体，经IPTG诱导，对培养物包涵体洗涤、溶解，用His标签蛋白磁珠纯化后，透析复性、纯化得到重组蛋白PPV VP2，‑80℃保存备用；S4：将S3制得的重组蛋白PPV VP2稀释，点样在芯片载体上，所述芯片载体为环氧基片，干燥，封闭，洗涤，制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1：优化PPVVP2密码子，合成优化的猪细小病毒PPVVP2基因(SEQIDNo.1)；S2：将S1制得的猪细小病毒PPVVP2基因克隆至载体pColdI，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2；S3：将S2制得的阳性克隆pColdI-VP2转化至大肠杆菌Rossetta2，培养转化体，经IPTG诱导，对培养物包涵体洗涤、溶解，用His标签蛋白磁珠纯化后，透析复性、纯化得到重组蛋白PPVVP2，-80℃保存备用；S4：将S3制得的重组蛋白PPVVP2稀释，点样在芯片载体上，所述芯片载体为环氧基片，干燥，封闭，洗涤，制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2中，pColdI质粒和S1合成的PPVVP2基因用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切，酶切产物胶回收纯化，将纯化的酶切产物用T4Ligase连接，于16℃连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，并涂布于氨苄抗性的LA平板，37℃培养过夜，提取质粒，进行双酶切切验证，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述重组蛋白PPVVP2的稀释方法为用2×蛋白芯片点样液稀释，稀释至浓度为0.05-0.4mg/ml，优选的，0.3-0.4mg/ml；所述点样方式为PersonalArrayer16接触式点样系统点制芯片；所述干燥条...

【专利技术属性】
技术研发人员：周斌，侯金秀，阚琳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32