猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT‑PCR诊断试剂盒及其检测方法，包括：反转录混合液：SADSCoV‑1R下游引物、PDCoV‑1R下游引物、AMV反转录酶和酶抑制剂；一扩混合液：SADSCoV‑1F上游引物、SADSCoV‑1R下游引物、PDCoV‑1F上游引物、PDCoV‑1R下游引物和DNA聚合酶；二扩混合液：SADSCoV‑2F上游引物、SADSCoV‑2R下游引物、PDCoV‑2F上游引物、PDCoV‑2R下游引物和DNA聚合酶；阴、阳性对照。该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高，能快速确诊并区分SADS‑CoV与PDCoV感染，其检测方法易于操作、方便快捷。

Diagnostic kit for pig acute diarrhea syndrome coronavirus and delta coronavirus RT-PCR and its detection method

The present invention provides a RT PCR diagnostic kit for porcine acute diarrhea syndrome coronavirus and delt coronavirus and its detection methods, including: reverse transcriptional mixture: downstream primers of SADSCoV 1R, downstream primers of PDCoV 1R, AMV reverse transcriptase and enzyme inhibitors; an extender mixture: SADSCoV 1F upstream primers, SADSCoV 1R 1R The downstream primers, the upstream primers of PDCoV 1F, the downstream primers of PDCoV 1R and the DNA polymerase, and the two extender mixture: the upstream primers of SADSCoV 2F, the downstream primers of SADSCoV 2R, the upstream primers of PDCoV 2F, the downstream primers and the polymerase in the downstream, and the negative and positive controls. The kit has high sensitivity, good specificity and high stability. It can quickly diagnose and distinguish SADS CoV and PDCoV infection, and its detection method is easy to operate, convenient and quick.

【技术实现步骤摘要】
猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断
，具体涉及猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
2016年10月，在广东省清远市某猪场开始爆发一种引起急性腹泻和呕吐为特征的传染病，随后蔓延至周围150公里范围的3个猪场。截止2017年5月，该病共导致4个猪场24693头仔猪死亡，死亡率达64％。病原检测发现，常见引起腹泻、呕吐的流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒均为阴性，提示这一疫情是一种新的疫病，并将这一新病命名为猪急性腹泻综合征(Swineacutediarrheasyndrome，SADS)。周鹏等通过高通量测序技术，最终确认病原为猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swineacutediarrheasyndromecoronavirus,SADS-CoV)。猪德尔塔冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV)是尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科德尔塔冠状病毒属成员。该病毒于2012年在中国香港首次报道，约10％的猪粪便样品呈PDCoV阳性，美国于2014年2月在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV，感染猪的临床症状类似于猪流行性腹泻病毒感染，主要表现为仔猪、母猪水样腹泻和仔猪死亡。国内陈建飞等成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株。由于SADS与德尔塔冠状病毒感染为新发猪群传染病，且临床症状相似，急需要开发一种快速鉴别诊断试剂盒，为临床快速确诊SADS和德尔塔冠状病毒感染提供技术手段。专利技术内容针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，能快速确诊并区分SADS-CoV与PDCoV感染，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，节省检测成本。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现。(一)一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，包括：反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照；所述反转录混合液包含灭菌水、dNTP、AMVBuffer、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1R下游引物、AMV反转录酶和HPRIRNA酶抑制剂；所述一扩混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、SADSCoV-1F上游引物、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1F上游引物、PDCoV-1R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述二扩混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、SADSCoV-2F上游引物、SADSCoV-2R下游引物、PDCoV-2F上游引物、PDCoV-2R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为SADSCoVM基因阳性质粒和PDCoVS基因阳性质粒混合溶液。优选的，所述反转录混合液包含：DEPC处理的灭菌水、2.5mmol·L-1dNTP、5×AMVBuffer、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物、5U/μLAMV反转录酶和40U/μLHPRIRNA酶抑制剂；每个反应体积比为9︰4︰4︰1︰1︰0.5︰0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；优选的，所述一扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-1F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。优选的，所述二扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-2F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-2R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-2F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-2R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。优选的，所述SADSCoV-1F上游引物的序列为：5’-ATGACTGATT-CTAACAACAC-3’；所述SADSCoV-1R下游引物的序列为：5’-TTAGACTAAATGCAGCAA-3’。优选的，所述SADSCoV-2F上游引物的序列为：5’-TCTTCTCCTTCAGCATTCT-3’；所述SADSCoV-2R下游引物的序列为：5’-TGCAGGCTGCACACCAGTA-3’。优选的，所述PDCoV-1F上游引物的序列为：5’-TTCTTACATAAACCCACGAG-3’；所述PDCoV-1R下游引物的序列为：5’-GCCTGAAGTAAGGCTTAGTG-3’。优选的，所述PDCoV-2F上游引物的序列为：5’-AGCATGTATCTCCTACCTA-3’；所述PDCoV-2R下游引物的序列为：5’-AACTACTGACTTATCACAAT-3’。(二)一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：步骤1，RNA提取与反转录采用TRIzolReagent试剂法提取待检样品RNA，得待检样品RNA；取反转录混合液，加入所述待检样品RNA，在42℃条件下水浴反转录90min，得待检样品反转录产物，取出置于-20℃保存，备用；步骤2，PCR扩增子步骤2.1，取一扩混合液，加入所述待检样品反转录产物，混合均匀后进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性5min、94℃反应45s、52℃反应50s、72℃反应50s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，得待检样品一扩产物；子步骤2.2，取二扩混合液，加入所述待检样品一扩产物，混合均匀后进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性5min、94℃反应30s、54℃反应30s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，得待检样品二扩产物；步骤3，采用步骤1和步骤2的方法分别对阴性对照和阳性对照处理，得阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物；步骤4，电泳检测通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品二扩产物、阴性对照样品二扩产物和阳性对照样品二扩产物进行电泳检测，并进行判断。优选的，所述反转录混合液包含灭菌水、dNTP、AMVBuffer、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1R下游引物、AMV反转录酶和HPRIRNA酶抑制剂；所述一扩混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、SADSCoV-1F上游引物、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1F上游引物、PDCoV-1R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述二扩混合液包含灭菌三本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT‑PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括：反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照；所述反转录混合液包含灭菌水、dNTP、AMV Buffer、SADSCoV‑1R下游引物、PDCoV‑1R下游引物、AMV反转录酶和HPR I RNA酶抑制剂；所述一扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV‑1F上游引物、SADSCoV‑1R下游引物、PDCoV‑1F上游引物、PDCoV‑1R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述二扩混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、SADSCoV‑2F上游引物、SADSCoV‑2R下游引物、PDCoV‑2F上游引物、PDCoV‑2R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为SADSCoV M基因阳性质粒和PDCoV S基因阳性质粒混合溶液。

【技术特征摘要】
1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括：反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照；所述反转录混合液包含灭菌水、dNTP、AMVBuffer、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1R下游引物、AMV反转录酶和HPRIRNA酶抑制剂；所述一扩混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、SADSCoV-1F上游引物、SADSCoV-1R下游引物、PDCoV-1F上游引物、PDCoV-1R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述二扩混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、SADSCoV-2F上游引物、SADSCoV-2R下游引物、PDCoV-2F上游引物、PDCoV-2R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为SADSCoVM基因阳性质粒和PDCoVS基因阳性质粒混合溶液。2.根据权利要求1所述的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述反转录混合液包含：DEPC处理的灭菌水、2.5mmol·L-1dNTP、5×AMVBuffer、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物、5U/μLAMV反转录酶和40U/μLHPRIRNA酶抑制剂；每个反应体积比为9︰4︰4︰1︰1︰0.5︰0.5，共计20μL，50个反应共计1000μL，装成1管；所述一扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-1F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-1R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-1F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-1R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管；所述二扩混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1SADSCoV-2F上游引物、25μmol·L-1SADSCoV-2R下游引物、25μmol·L-1PDCoV-2F上游引物、25μmol·L-1PDCoV-2R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为16︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，50个反应共计1150μL，装成1管。3.根据权利要求2所述的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述SADSCoV-1F上游引物的序列为：5’-ATGACTGATTCTAACAACAC-3’；所述SADSCoV-1R下游引物的序列为：5’-TTAGACTAAATGCAGCAA-3’。4.根据权利要求2所述的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述SADSCoV-2F上游引物的序列为：5’-TCTTCTCCTTCAGCATTCT-3’；所述SADSCoV-2R下游引物的序列为：5’-TGCAGGCTGCACACCAGTA-3’。5.根据权利要求2所述的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述PDCoV-1F上游引物的序列为：5’-TTCTTACATAAACCCACGAG-3’；所述PDCoV-1R下游引物的序列为：5’-GCCTGAAGTAAGGCTTAGTG-3’。6.根据权利要求2所述的猪急性腹泻综合征冠状病毒与德尔塔冠状病毒RT-PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述PDCoV-2F上游引物的序列为：5’-AGCATGTATCTCCTACCTA-3’；所述PDCoV-2R下游引物的序列为：5’-...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小甫，吴旭锦，
申请(专利权)人：咸阳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61