一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及水产病害微生物检测领域，具体涉及一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒，以及上述引物组的应用。本发明专利技术所述引物组包括两条外引物F3‑EHV和B3‑EHV、两条内引物FIP‑EHV和BIP‑EHV、两条环引物LF‑EHV和LB‑EHV；所述试剂盒包括上述引物组，反应缓冲液，DNA聚合酶和阳性对照。利用本发明专利技术提供的引物组和试剂盒能快速、灵敏的判定检测样本中是否含有鳗鲡疱疹病毒，从而实现对鳗鲡疱疹病毒的检测。

Primer group, reagent kit for detecting eel herpesvirus and its application

The invention relates to the field of microbial detection for aquatic diseases, in particular to a primer group, a kit for the detection of eel herpes virus and the application of the primer group. The primer group of the present invention includes two primers F3 EHV and B3 EHV, two primers FIP EHV and BIP EHV, two ring primers LF EHV and LB EHV; the kit includes the primer group, reaction buffer, polymerase and positive control. The primer group and kit provided by the invention can quickly and sensitively determine whether the herpes virus of eel is contained in the samples, and the detection of eel herpes virus is realized.

【技术实现步骤摘要】
一种检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒及其应用
本专利技术涉及水产病害微生物检测领域，具体涉及一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒，以及上述引物组的应用。技术背景我国是世界主要鳗鲡养殖国家之一，其产值在我国的水产品出口贸易中占有重要地位。养殖的品种主要有日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡等。由于大规模的集约化养殖，重大病毒性疫病爆发日益频繁，造成巨额的经济损失。鳗鲡疾病的病原学研究方面，鳗鲡细菌性疾病、寄生虫疾病的研究较多，且已经有一套比较成熟的预防和治疗方法。而在鳗鲡病毒性疾病领域的研究较少，由于对病原不了解，使得一旦病毒性疾病爆发，常呈区域性传播，造成巨额的经济损失。鳗鲡疱疹病毒(Eelherpesvirus,EHV)在我国养殖的鳗鲡中普遍存在。临床和病理学研究表明，EHV可引起鱼粘液分泌增多，病鱼眼突和腹胀，肝脏褪色，肾脏肿大、胆囊膨大与显著的肠炎，明显增高的死亡率等。在无明显临床症状的鳗鲡中，也可检测到EHV。目前开发的EHV的检测方法包括PCR、定量PCR等检测方法。这些检测技术具有特异性好等优点，但都需要PCR仪等专业的仪器设备和较专业的操作人员，很难在基层推广应用。环介导等温扩增技术(LAMP)是在PCR基础上发展的核酸扩增技术，只需要一个恒温装置，具有检测快速、灵敏度高、操作简便、成本低、检测结果易于判定等优点，已广泛应用于病原检测领域。目前，未见利用LAMP方法对EHV进行检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组、试剂盒以及上述引物组的应用。本专利技术提供了一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组，所述引物组包括两条外引物F3-EHV和B3-EHV、两条内引物FIP-EHV和BIP-EHV、两条环引物LF-EHV和LB-EHV；各引物的碱基序列5’-3’如下：F3-EHV：GGCATCGAGATGATGCACAA(SEQIDNo.1)；B3-EHV：TCCGCGGAAGAGAGACAG(SEQIDNo.2)；FIP-EHV：GAGGAACCTGGTGGCATCAGACGACAACATGCCGTGGATCG(SEQIDNo.3)；BIP-EHV：ATCACTTCAAAACCGGCCGCGACGGTGTCGTAGTACGGATA(SEQIDNo.4)；LF-EHV：GCGCGGCAGGCATATCTA(SEQIDNo.5)；LB-EHV：TCGAAGGCGCTGTACTACAA(SEQIDNo.6)。本专利技术还提供了上述引物组在制备检测鳗鲡疱疹病毒试剂盒中的应用。本专利技术提供了一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组，以及反应缓冲液、DNA聚合酶和阳性对照。优选的，所述引物组含有30～50μMF3-EHV，30～50μMB3-EHV，3～7μMFIP-EHV，3～7μMBIP-EHV，15～25μMLF-EHV，15～25μMLB-EHV。优选的，所述反应缓冲液含有30～50mMTris缓冲液、15～25mMKCl、7～25mMMgSO4、15～25mM(NH4)2SO4、体积百分比0.1～0.3％吐温20、1～2M甘氨酸三甲胺内盐、2.5～4mMeachdNTPs、0.5～1.5mMMnCL2、40～60μM钙黄绿素。优选的，所述的DNA聚合酶为Bst2.0WarmStartDNA聚合酶。优选的，所述的阳性对照为含有鳗鲡疱疹病毒ORF51基因的质粒。有益效果：本专利技术提供的引物组针对鳗鲡疱疹病毒，能特异性地识别靶序列的八个不同位点，并在反应中产生茎环结构，具有良好的扩增特异性。本专利技术提供的检测试剂盒利用LAMP技术检测EHV，具有检测特异性强，检测灵敏度高等特点，可检测最低10个拷贝的靶标DNA。试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可实现现场的高通量快速检测；克服了传统的基于PCR的检测方法需要PCR仪等仪器设备，对检测人员的技术素质要求高、检测时间长等缺点。本专利技术的检测试剂盒可在不开盖的条件下，通过肉眼观察判定是否有目标基因的扩增：在可见光下显示黄绿色可判定为阳性，显示为棕红色可判定为阴性；或者，在紫外光下显示绿色可判定为阳性，未显示绿色可判定为阴性。利用本专利技术提供的试剂盒，可在鳗鲡脱粘败血病样本中100％检出鳗鲡疱疹病毒。附图说明图1为本专利技术实施例4利用琼脂糖凝胶电泳分析LAMP扩增产物的电泳图，其中M为maker、1为细胞培养的EHV、2为病料中的EHV、3为阳性对照；图2为本专利技术实施例5中LAMP扩增后的显示结果，其中1为鲤疱疹病毒、2为EHV、3为鳗鲡虹彩病毒、4为EHV；图3为本专利技术实施例6中LAMP扩增后的显示结果，其中1～8分别代表100、101、102、103、104、105、106、107拷贝的阳性对照DNA。图4为本专利技术实施例7中LAMP扩增后的显示结果，其中1和5为鳗鲡脱粘败血病病料1，2和6为鳗鲡脱粘败血病病料2，3和7为未患病鳗鲡DNA，4和8为阳性对照DNA；1～4为自然光下显色结果；5～8为紫外光下显色结果。具体实施方式本专利技术提供了一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组，所述引物组包括两条外引物F3-EHV和B3-EHV、两条内引物FIP-EHV和BIP-EHV、两条环引物LF-EHV和LB-EHV；各引物的碱基序列5’-3’如下：F3-EHV：GGCATCGAGATGATGCACAA；B3-EHV：TCCGCGGAAGAGAGACAG；FIP-EHV：GAGGAACCTGGTGGCATCAGACGACAACATGCCGTGGATCG；BIP-EHV：ATCACTTCAAAACCGGCCGCGACGGTGTCGTAGTACGGATA；LF-EHV：GCGCGGCAGGCATATCTA；LB-EHV：TCGAAGGCGCTGTACTACAA。本专利技术通过细胞分离、鉴定，得到10株EHV；本专利技术通过克隆上述10株EHV的ORF51开放阅读框序列，分析同源性，再根据在线软件PrimerExplorerV5(http://primerexplorer.jp/)在保守区设计了上述用于检测鳗鲡疱疹病毒的LAMP引物组。本专利技术利用上述引物组对EHV的靶标序列进行LAMP扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行扩增特异性验证，比较引物的扩增效率。结果证明：本专利技术提供的LAMP检测引物组相较于从EHV的ORF4、ORF8、ORF33、ORF95、ORF115等基因保守区设计的引物组，具有扩增效率高、特异性好的优点。本专利技术还提供了上述引物组在制备检测鳗鲡疱疹病毒试剂盒中的应用。以上述引物组为唯一检测引物，配合本领域可接受的缓冲液、DNA聚合酶以及阳性对照样本，制得用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒。本专利技术提供了一种具体的用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组，以及反应缓冲液、DNA聚合酶和阳性对照。在本专利技术中，所述引物组含有F3-EHV，B3-EHV，FIP-EHV，BIP-EHV，LF-EHV和LB-EHV共6条引物；所述F3-EHV的浓度优选为30～50μM，更优选为40μM；所述B3-EHV的浓度优选为30～50μM，更优选为40μM；所述FIP-EHV的浓度优选为3～7μM，更优选为5μM；所述BI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括两条外引物F3‑EHV和B3‑EHV、两条内引物FIP‑EHV和BIP‑EHV、两条环引物LF‑EHV和LB‑EHV；各引物的碱基序列5’‑3’如下：F3‑EHV：GGCATCGAGATGATGCACAA；B3‑EHV：TCCGCGGAAGAGAGACAG；FIP‑EHV：GAGGAACCTGGTGGCATCAGACGACAACATGCCGTGGATCG；BIP‑EHV：ATCACTTCAAAACCGGCCGCGACGGTGTCGTAGTACGGATA；LF‑EHV：GCGCGGCAGGCATATCTA；LB‑EHV：TCGAAGGCGCTGTACTACAA。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括两条外引物F3-EHV和B3-EHV、两条内引物FIP-EHV和BIP-EHV、两条环引物LF-EHV和LB-EHV；各引物的碱基序列5’-3’如下：F3-EHV：GGCATCGAGATGATGCACAA；B3-EHV：TCCGCGGAAGAGAGACAG；FIP-EHV：GAGGAACCTGGTGGCATCAGACGACAACATGCCGTGGATCG；BIP-EHV：ATCACTTCAAAACCGGCCGCGACGGTGTCGTAGTACGGATA；LF-EHV：GCGCGGCAGGCATATCTA；LB-EHV：TCGAAGGCGCTGTACTACAA。2.权利要求1所述引物组在制备检测鳗鲡疱疹病毒试剂盒中的应用。3.一种用于检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组，反...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛均青，陈强，宋铁英，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35