基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法，属于生物分子检测领域。本发明专利技术公开了基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法及试剂盒，包含肿瘤组织DNA提取的方法；设计肺癌靶向治疗分子诊断相关基因的panel；PCR引物扩增；文库构建和高通量测序的流程方法。本发明专利技术公开的确定肺癌基因突变位点的特异性引物和试剂盒用于检测16个致癌基因的316个突变情况，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。本发明专利技术的检测方法和试剂盒灵敏度高达1％，检测结果明确客观，可以直接反应相关基因的具体突变位点，对癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测有重要意义。

Primers, kits and methods for identifying lung cancer gene mutation sites based on high throughput sequencing technology

The invention discloses a primer, a kit and a method for determining the mutation site of lung cancer gene based on high-throughput sequencing technology, and belongs to the field of biomolecular detection. The invention discloses a method and a kit for determining the mutant loci of lung cancer gene based on high throughput sequencing technology, including the method of DNA extraction of tumor tissue, the design of panel for molecular diagnosis related genes for lung cancer targeting therapy, PCR primer amplification, library construction and high throughput sequencing process. Specific primers and kits for determining the mutant loci of the lung cancer gene are used to detect 316 mutations in the 16 oncogene, which can be a replacement, insertion and / or deletion of one or more bases. The sensitivity of the detection method and kit is as high as 1%, and the detection results are clear and objective. It can directly respond to the specific mutation sites of the related genes. It is of great significance to the early diagnosis and auxiliary diagnosis and screening of cancer and the monitoring of cancer after cancer.

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法
本专利技术属于生物分子检测领域，更具体地说，涉及一种基于高通量测序技术的肺癌靶向治疗分子诊断引物、试剂盒及诊断方法。
技术介绍
根据国家癌症中心公布的最新数字显示，我国恶性肿瘤发病及死亡居首位的是肺癌，每年新发病例约73.3万，死亡约59.1万，占所有因癌死亡人数的35％以上，超越了交通事故、自然灾害等，成为了影响我国人口死亡的最主要因素。对比过去三十年统计数据，我国肺癌的死亡率上升了465％。而根据美国癌症协会公布的《2017年度美国癌症数据调查报告》显示，美国肺癌发病率和死亡率持续显著下降。该报告分析认为，美国肺癌发病率和死亡率呈现双下降主要得益于三大因素：积极控烟、推广筛查和新型疗法的应用。大量学者和医务人员也认为推广筛查和新型疗法的应用将大大推进我国的肺癌筛查、诊断和治疗水平。目前，我国临床上对肺癌仍以组织病理学诊断为确诊和治疗的依据，使用的治疗方法是根据其分期采取手术或手术结合放化疗进行治疗。但由于肺癌缺乏有效的早期诊断手段以及受国民健康意识的影响，70％以上的患者在确诊时已是中晚期，错过了最佳手术时期。而肺癌各种化疗方案的总体有效性仅为30％左右，同时有些患者无法耐受化疗和放疗以及化疗后很快耐药，从而导致肺癌患者确诊后5年生存率很低，晚期患者五年生存期小于15％。近年来，分子靶向治疗逐渐受到人们的关注且在欧美国家已广泛应用于临床。分子靶向治疗是使用药物针对已经明确的致癌基因，特异地杀死肿瘤细胞，因此分子靶向治疗的副作用更小和特异性更高，也为晚期肺癌患者提供了新的有效治疗手段。这其中最典型的例子是肺腺癌的EGFR突变靶向治疗。在我国，约30％非小细胞肺癌患者存在EGFR突变。对这类患者采用EGFR激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼，有效率可以达到70％～80％。过去十年针对肺癌的特定基因突变开展的靶向治疗就已让晚期肺癌患者中位生存期显著增加2.4倍，从此前的14.1个月延长至33.5个月，相较于传统的治疗方法优势明显。目前，临床上关于肺癌的靶向药物，然而除激酶抑制剂-吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼以外，还有多种基因特异位点的抑制剂对肺癌显示出较好的抑制效果。然而，并非所有的肺癌患者对分子靶向治疗均表现出较好的疗效，比如现有资料表明EGFR基因突变与EGFR激酶抑制剂敏感性相关，EGFR基因突变患者对EGFR激酶抑制剂吉非替尼的有效率达60％以上，而EGFR基因野生型(即未突变型)患者的有效率仅为10％～15％。因此，明确肺癌组织的突变状况对靶向药物的临床使用和疗效预测有重要的指导意义。而分子靶向药物的使用需要明确肿瘤患者存在可靶向治疗的基因突变，所以基因突变的检测是确定治疗方案的关键。临床中肺癌的诊断样品70％是小的活检样品，其首先被用于临床病理学诊断，剩下的有限组织若要用作分子诊断，则对其核酸含量及提取方法都有较高的技术操作要求。且病理形态相同的肺癌，由于分子遗传学改变，在分子水平上呈现高度异质，这种组织的异质性使得一些活检样本无法反应肿瘤基因突变的全貌，从而导致对靶向治疗的反应差别很大。同时，肿瘤异质性也是不断变化的，无法通过一两次的活检或组织样本来检测患者的病情。高通量测序技术通过多基因、多位点的集成式检测，可一次性检测与肿瘤靶向治疗密切相关的基因位点。它所需的核酸要求不高，是应用于肿瘤基因检测的一个很好的选择。此外，肿瘤是基因组疾病，单一基因的检测难以满足指导个体化治疗的需要。而以高通量测序和大数据分析为基础，对肺癌进行多基因突变检测，能够精确的地给出患者癌组织的基因突变信息，从而指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。同时，也可用于肺癌病人的早期诊断和筛查。目前，在美国高通量测序技术已广泛用于癌症的筛查、诊断和治疗过程中，对美国癌症的死亡率下降做出了突出的贡献。然而，在国内市场上对于肺癌的检测主要停留在单个或几个位点的检测水平，检测方法一般使用荧光PCR、芯片分析等方法，例如，中国专利申请号为201310200169.7，申请公布日为2013年9月11日的专利文件公开了一种用于检测ALK基因表达的探针、引物及试剂盒，包括以下序列：SEQIDNO1-SEQIDNO12，该专利技术的引物和探针可以特异检测ALK基因表达差异，以确定是否存在ALK基因融合，该专利技术建立的用于检测ALK基因表达差异的实时荧光PCR体系，通过检测5’端和3’端基因表达量的差异，提供ALK基因表达差异外显子的定性评估，适用于肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。中国专利申请号为201310068052.8，申请公布日为2013年6月5日的专利文件公开了一种早期肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。该专利技术针对肺癌的早期检测与之相关联的EGFR，CHRNA3，CHRNA5及ERCC1基因内部的rs2239680，rs16969968，rs12910984及rs2298881位点的基因型进行分型，利用以上4个位点联合作为肺癌早期诊断的标志物，提高了检测的真实性和准确性。然而，由于癌症是基因组疾病，单一或几个基因突变位点的检测难以满足指导个体化治疗的需要。已经报道的几种检测肺癌的方法只包含了极少的几个基因突变位点，不能有效的反应患者癌症突变的全貌，难以用于临床指导，且临床发现单一基因的靶向用药多数存在治疗无效或很快产生药物抗性等不利反应，因此，我们需要一种更加全面有效的检测手段。同时，对癌症进行全基因组或全外显子测序可以获得海量的基因突变数据。然而，这些测序费用极其昂贵，后期数据分析要求极高、耗时长达数月，且由于我们对绝大多数基因突变在癌症中的功能认识有限，目前仅针对极少的一部分基因研发出了靶向药物。因此，全基因组或全外显子测序检测肺癌的方法无法应用于临床需求。根据前期研究表明，肺癌存在多种基因突变，其中最常见的突变包括致癌基因AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN，更重要的是这些突变临床上均已开发或正在测试靶向药物，对于这些基因突变的检测将更好的指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。综上所述，现有的肺癌的检测方法都存在一定的缺陷，例如结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多、检测基因少、通量低等问题。而现在市场上存在的一些基于高通量测序技术检测肺癌的方法，存在对样品的要求较高、目的性不强、操作繁琐、引物或探针设计复杂、检测费用高等缺点，特别是不能指导靶向用药，因此急需一种新型的检测方法以满足市场和医疗的需求。
技术实现思路
1.要解决的问题针对现有的肺癌基因突变位点难以准确确定、重复性差、假阳性和假阴性多、通量低等问题，本专利技术提供一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的引物、试剂盒及方法，用于检测确定16个致癌基因的316个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。2.技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定肺癌基因突变位点的特异性引物，其特征在于：引物序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.82中的一种或多种组合。

【技术特征摘要】
1.一种确定肺癌基因突变位点的特异性引物，其特征在于：引物序列为SEQIDNo.1～SEQIDNo.82中的一种或多种组合。2.一种肺癌靶向治疗分子诊断试剂盒，其特征在于：包括引物序列为SEQIDNo.1～SEQIDNo.82中的一种或多种组合。3.一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：包括以下步骤：A.从待测样品中提取基因组DNA；B.使用权利要求1中所述的基因特异性引物SEQIDNo.1～SEQIDNo.82，对步骤A中提取的基因组DNA上的目的片段进行多重PCR扩增；C.对步骤B中得到的多重PCR扩增产物进行纯化；D.对步骤C中的纯化产物进行二轮PCR扩增，引入测序接头和barcode；E.对步骤D中的二轮PCR产物进行纯化和质控，完成测序文库的构建；F.对步骤E中构建的测序文库进行高通量测序，获得目的基因片段的序列信息；G.将步骤F中的获得的目的基因片段的序列信息与正常的基因序列进行比对分析，得到目的基因片段的突变信息。4.根据权利要求3所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤A中的待测样品包括但不限于新鲜肿瘤组织、新鲜活检组织和石蜡包埋肿瘤组织；提取基因组DNA时，使用但不限于组织DNA提取试剂盒和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒。5.根据权利要求3所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤B中所述的基因组DNA上的目的片段是指分别包含肺癌16个靶向治疗分子诊断基因的316个突变位点的基因片段，16个靶向治疗分子诊断基因分别为AKT1、ALK、ARAF、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、FGFR3、KIT、KRAS、MAP2K1、MTOR、NRAS、PDGFRA、PIK3CA和PTEN。6.根据权利要求3或5所述的一种基于高通量测序技术确定肺癌基因突变位点的方法，其特征在于：步骤B中多重PCR扩增的反应体系为：2XMasterMix(包含DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs)25μL、包含所述SEQNo.1～SEQNo.82引物的引物panel10μL、待测DNA样品10～20ng，用ddH2O加至50μL，引物浓度为10nMeach；步骤B中多重...

【专利技术属性】
技术研发人员：林文楚，王伟，洪波，李河南，尹燕萍，王晓雪，李浩浩，李圆，邹晶露，邓科，刘晓莉，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，合肥中科金臻生物医学有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34