蝉拟青霉及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种蝉拟青霉及在制备抗菌剂、益生菌制剂及抗菌保鲜膜中的应用，首次从野生虫生真菌蝉花中分离得到一株新菌株—蝉拟青霉CH 113.1，该菌株发酵产物对常见病原微生物具有抑制作用，对大肠杆菌的抑制率可达70％以上，该生物抑菌剂能应用在食品保鲜中。本发明专利技术显示出该菌株在食品等领域具有良好的应用前景。

Penicillium cicada and its application

The invention discloses a kind of Paecilomyces cicadin and its application in preparation of antimicrobial agents, probiotics and antibacterial preservative film. A new strain, quasi Penicillium cicada CH 113.1, is isolated from the wild cicada cicada for the first time. The fermentation product has inhibitory effect on common pathogenic microorganisms and the inhibition rate of Escherichia coli can reach 70. More than%, the biological bacteriostatic agent can be applied to food preservation. The invention shows that the strain has good application prospects in food and other fields.

【技术实现步骤摘要】
蝉拟青霉及应用(一)
本专利技术涉及一种蝉拟青霉及其作为抑菌剂的应用。(二)
技术介绍
致病菌是指能引起疾病的微生物，主要包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。尽管绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病，从而对人体产生危害。抑菌剂就是能抑制细菌或真菌生长的物质。抑菌剂可能无法杀死菌体，但它可以抑制其生长，阻止有害的细菌或真菌滋生过多、危害健康。常用的抑菌剂(Bacteriostat)是一些抗生素类物质，主要包括磺胺类、四环素、氯霉素、红霉素、林可霉素等。近年来，随着抗生素过度使用，细菌及真菌的耐药性不断增加，致使一些抗生素疗效降低和多重耐药致病菌的出现，在临床上造成了极大的威胁，因此迫切需要筛选新型抑菌活性物质以满足临床的需求。益生菌可抑制有害菌，平衡宿主微生态平衡。动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌等。迄今为止，科学家已发现的益生菌大体上可分成三大类：乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌类。随着益生菌的出现，抑菌剂一词得到了新的诠释，这种生物源抑菌剂彻底打破了人类传统医学治疗和清洁护理方式，特采用活性益生菌(有益菌)来抑制致病菌(有害菌)的感染，以“益菌抑菌”的生物理念为人类健康发展带入一个崭新的时期。研究发现，抑菌物质主要通过破坏微生物的细胞膜、细胞壁和DNA结构，影响基因表达、细胞呼吸作用和能量代谢等途径发挥抑菌作用。目前，市场上所使用的抑菌剂多为化学制剂，对人体和环境可造成一定伤害，而生物抑菌剂以低毒、高效、环保的特点，逐渐成为化学抑菌剂的最佳替代品。基于以上背景，研究新型生物源抑菌剂必将成为该领域的研究热点之一。蝉花(Cordycepscicadae)，又名蝉蛹草，是指麦角菌科(Clavicipttaceus)虫草属(Cordyceps)的真菌蝉拟青霉(Paecilomycescicadae)寄生在蝉若虫上所形成的复合物。蝉拟青霉曾被视为“中药八珍”之一。蝉花与冬虫夏草、北虫草齐名，为我国传统的三大药用虫草之一，且蝉花与冬虫夏草活性成分相似，含有真菌多糖、虫草酸、虫草素、腺苷等多种活性成分，具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、改善肾功能、降血糖和抑菌等作用。为此，本课题组从野生蝉花出发，筛选出具有良好抑菌活性的蝉拟青霉，研究其生物活性，并探讨其在食品保鲜中的应用，为蝉花源生物抑菌产品深度开发提供理论依据。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株新菌株—蝉拟青霉(Paecilomycescicadae)CH113.1，以及其发酵产物作为抑菌剂的应用，该菌株发酵产物具有抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等病原微生物的活性，可破坏大肠杆菌的细胞结构，改变大肠杆菌的壁膜通透性，破坏菌体膜蛋白。此外，本专利技术研究确定了蝉拟青霉抑菌剂的配方，并探讨其在抑菌保鲜膜的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株—蝉拟青霉(Paecilomycescicadae)CH113.1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年01月04日，保藏编号为CCTCCNO：M2017004，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本专利技术还提供一种所述蝉拟青霉CH113.1在制备抗菌剂中的应用，所述抗菌剂为枯草芽孢杆菌抗菌剂、金黄色葡萄糖球菌抗菌剂或大肠杆菌抗菌剂。本专利技术所述蝉拟青霉CH113.1经发酵培养获得的上清液中的抗菌剂，其可破坏大肠杆菌的细胞结构，改变大肠杆菌的壁膜通透性，破坏菌体膜蛋白。所述的蝉拟青霉CH113.1发酵上清液中的抗菌剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.050mg/mL。本专利技术所述抗菌剂为蝉拟青霉CH113.1经28℃、200rpm发酵培养后的发酵液离心，取上清液a分离纯化获得的。本专利技术所述抗菌剂按如下方法制备：(1)斜面培养：将蝉拟青霉CH113.1接种至斜面培养基，28℃培养5天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉10g/L，溶剂为自来水，pH值自然；(2)发酵培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至发酵培养基，28℃、200rpm培养5d，发酵液离心(4℃，12000g离心30min)，收集上清液a；所述发酵培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为自来水，pH值自然。(3)抗菌剂：取50mL上清液a，加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜沉淀多糖；4℃、12000g离心30min，收集上清液b，旋转蒸发仪蒸干，用无菌水溶解后于4℃缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵质量终浓度为60％，静置过夜；4℃、12000g离心30min，收集上清液b，旋转蒸发仪蒸干，用无菌水溶解后于4℃缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵质量终浓度为60％，静置过夜；4℃、12000g离心30min，分别收集上清液c和沉淀c，上清液c用0.22μm滤膜过滤除菌，获得滤渣a；滤渣a用无菌水溶解后，过0.45μm滤膜，获得滤渣b；滤渣b冻干后用0.050mol/LNaAc-HAc缓冲液溶解并上CM-纤维柱52，以pH4.0～5.0、0.010～0.10mol/LNaAc-HAc缓冲液平衡柱子，以pH5.0～5.5、0.10～0.50mol/LNaAc-HAc缓冲液进行梯度洗脱，收集目标组分(优选每10mL为一管，测定抗菌活性，合并收集活力峰)经分子量截留值为1000Da超滤膜超滤浓缩，获得截留液a在-50℃冻干后用蒸馏水溶解并上SephadexG-25/G-50柱，洗脱液为pH6.0～7.0，0.010～0.10mol/L磷酸缓冲液，收集目标组分(优选每10mL为一管，测定抗菌活性，合并收集活力峰)经分子量截留值为1000Da超滤膜超滤浓缩，获得的截留液b在-50℃冻干后用蒸馏水溶解并上制备型HPLC，含体积浓度0.010％TFA的体积浓度10～80％乙腈水溶液洗脱，收集目标组分(优选每5.0mL为一管，测定抗菌活性，合并收集活力峰)-50℃冻干，于-20℃保存，获得抗菌剂。本专利技术还提供一种所述蝉拟青霉CH113.1在制备益生菌制剂中的应用。本专利技术还涉及一种所述蝉拟青霉CH113.1在制备抑菌保鲜膜中的应用，所述抑菌保鲜膜由蝉拟青霉CH113.1经28℃，200rpm发酵培养后的发酵液离心，取上清液a分离纯化获得的抑菌剂制成。进一步，所述抑菌保鲜膜按如下步骤制备：将干燥果胶溶解于蒸馏水中，并加入抗菌剂和甘油混合均匀制成膜液，充分搅拌和真空脱气后，倒入膜具中铺满铺平，随后置于真空干燥箱中40℃干燥，获得抑菌保鲜膜；所述膜液中果胶和甘油质量含量分别2.5％和3.0％，抑菌剂加入量为0.050mg/mL。优选倒膜量50.0g，揭膜放入密闭容器中待用，膜厚度0.15mm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：首次从野生虫生真菌蝉花中分离得到一株新菌株—蝉拟青霉CH113.1，该菌株发酵产物对常见病原微生物具有抑制作用，对大肠杆菌的抑制率可达70％以上，该生物抑菌剂能应用在食品保鲜中。本专利技术显示出该菌株在食品等领域具有良好的应用前景。(四)附图说明图1蝉花真菌分子生物学鉴定；A：rDNA-ITS扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)CH113.1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年01月04日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017004，保藏地址为中国武汉、武汉大学，邮编430072。

【技术特征摘要】
1.蝉拟青霉(Paecilomycescicadae)CH113.1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年01月04日，保藏编号为CCTCCNO：M2017004，保藏地址为中国武汉、武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述蝉拟青霉CH113.1在制备抗菌剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗菌剂为枯草芽孢杆菌抗菌剂、金黄色葡萄糖球菌抗菌剂或大肠杆菌抗菌剂。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗菌剂为蝉拟青霉CH113.1经28℃，200rpm发酵培养后的发酵液离心，取上清液a分离纯化获得的。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述上清液a按如下步骤制备：将蝉拟青霉CH113.1接种至斜面培养基，28℃培养5天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉10g/L，溶剂为自来水，pH值自然；从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至发酵培养基，28℃，200rpm培养5d，发酵液离心，收集上清液a；所述发酵培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为自来水，pH值自然。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述上清液a分离纯化方法为：取上清液a，加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜后于4℃、12000g离心30min，收集上清液b，旋转蒸发仪蒸干，用无菌水溶解后于4℃缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵质量终浓度为60％，静置过夜；4℃、12000g离心30min，分别收集上清液c和沉淀c，上清液c用0.22μm滤膜过滤除菌，获得滤渣a；滤渣a用无...

【专利技术属性】
技术研发人员：石陆娥，张瑜，唐振兴，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33