高产洛伐他汀杂色曲霉Av-2菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产洛伐他汀的杂色曲霉（Aspergillus versicolor）Av‑2菌株、用途和发酵生产方法。本发明专利技术所述杂色曲霉（A. versicolor）Av‑2菌株，保藏编号为：CCTCC NO:M 2016379，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年7月7日。本发明专利技术所筛选的杂色曲霉（A. versicolor）Av‑2菌株，具有高产洛伐他汀、培养简单等特性。洛伐他汀产量可达154μg/mL~158μg/mL。

High yield lovastatin Aspergillus versicolor Av-2 strain and its application

The invention belongs to the field of biological technology and microorganism, and relates to 1 strains of Aspergillus versicolor, Av 2 strain, use and fermentation method for producing lovastatin by liquid fermentation. The present invention has the A. versicolor Av strain 2, and the preservation number is: CCTCC NO:M 2016379. The preservation site is China's typical culture storage center. The preservation date is: July 7, 2016. The strain A. versicolor Av strain 2 has the characteristics of high production of lovastatin and simple cultivation. The yield of lovastatin can reach 154 mu g/mL~158 mu g/mL.

【技术实现步骤摘要】
高产洛伐他汀杂色曲霉Av-2菌株及其应用
本专利技术属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产洛伐他汀的杂色曲霉（Aspergillusversicolor）Av-2菌株、用途和发酵生产方法。
技术介绍
杂色曲霉（Aspergillusversicolor）是世界性广泛分布种，也是我国最常见的曲霉之一。杂色曲霉作为曲霉属的一种，能产生多种有用的活性代谢产物，分别具有抗菌、抗虫、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化，抗炎症、细胞免疫等多种生物活性。文献（罗寒,李晓栋,李晓明,等.红树林来源内生真菌杂色曲霉AspergillusversicolorMA-229次级代谢产物研究.中国抗生素杂志,2017,42(4):S14-S20.）从分离自红树林植物内生真菌的杂色曲霉MA-229的发酵产物中分离得到9个化合物，分别对小麦全蚀病菌和小麦赤霉病菌有较好的抑制活性，并且还有抗虫活性；文献（YanMX,MaoWJ,LiuX,etal.ExtracellularPolysaccharidewithNovelStructureandAntioxidantPropertyProducedbytheDeep-seaFungusAspergillusversicolorN(2)bC.CarbohydratePolymers,2016,147:272-281.）从深海中分离到1株杂色曲霉，可产生具有抗氧化活性的胞外多糖体；文献（巩婷,董世豪,朱平,等.海洋真菌杂色曲霉F62丁内酯类化合物研究.菌物学报,2014,33(3):706-712.）从海洋真菌杂色曲霉F62中分离得到6个丁内酯类活性化合物，均表现出较强的抗炎活性。大量文献表明杂色曲霉（A.versicolor）生物活性物质非常丰富。1980年，Alberts等从土曲霉（A.terreus）中提取到称为洛伐他汀（洛伐他汀）的化合物。洛伐他汀是降血脂的他汀类药物，可用于治疗心血管疾病；目前，洛伐他汀在食品和药品工业中已被广泛应用；因此，选育稳定高产洛伐他汀的曲霉菌株对并其发酵工艺条件进行优化，具有较好的现实意义和应用前景。
技术实现思路
针对市场上洛伐他汀需求日益增长，生产洛伐他汀优良工业菌株的缺乏等的问题。本专利技术的第一个目的是提供1株高产洛伐他汀杂色曲霉Av-2菌株，本专利技术的第二个目的是发酵生产的方法。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：本专利技术所述杂色曲霉(Aspergillusversicolor)Av-2菌株，保藏编号为：CCTCCNO:M2016379，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2016年7月7日。从各地不同生境收集的自然发酵样品中分离纯化获186株曲霉纯菌株；经薄层层析法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）测定发酵液中洛伐他汀含量筛选（附图1，附图2，附图3），获1株高产洛伐他汀的编号为Av-2曲霉菌株，该菌株分离自番茄表面；根据形态特征和ITS基因序列，鉴定Av-2曲霉菌株为杂色曲霉（Aspergillusversicolor）；Av-2曲霉菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2016379，保藏日期为：2016年7月7日。Av-2曲霉菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状或絮状，后变成灰绿色，边缘白色，15d菌落直径达50mm（附图4）；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，分支状；分生孢子头初为球形，后呈放射形（附图5，图6），顶囊呈半椭圆形至半球形；上半部或3/4部位着生小梗，小梗双层（附图6），分生孢子呈淡绿色，球形或近球形，粗糙，直径4~5μm×4~4.5μm（附图7）。rDNAITS基因：序列分析结果表明，ITS基因长度为545bp（附图8），与杂色曲霉（Aspergillusversicolor）亲关系最接近，达99%（附图9）。根据Av-2曲霉菌株的形态特征和rDNAITS基因序列，结合曲霉属（Aspergillus）分种检索表，鉴定Av-2菌株为杂色曲霉（Aspergillusversicolor）。Av-2曲霉菌株具有高产洛伐他汀、培养简单等特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，Av-2曲霉菌株通过液体发酵培养和发酵条件优化后，发酵培养80h~100h，洛伐他汀产量可达154μg/mL~158μg/mL（附图10）。用远藤章教授方法提取发酵液中的洛伐他汀，蒸干后得块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明洛伐他汀提取物结构与洛伐他汀标准品相一致。Av-2曲霉菌株是较有潜力的工业菌株。本专利技术的杂色曲霉（A.versicolor）Av-2菌株可用于发酵生产洛伐他汀。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：一种高产洛伐他汀的生产方法，该方法包括以下的步骤：1）用接种针挑少量所述的菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；2）取平皿中1菌饼接种于一级种子培养液中，摇床培养3d，制得一级种子；3）在二级种子培养液中，按6%加入一级种子，200r/min摇床培养2d成二级种子；4）在5L发酵罐发酵培养液中按20%接入二级种子进行发酵培养；发酵时间为80h~100h；5）过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中洛伐他汀，与滤液混合；提取洛伐他汀，蒸干后得块状晶体。作为优选，按重量百分比，PDA培养基包括：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1L，pH5.5~6.0；一级种子培养液包括：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0；二级种子培养液包括：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0；发酵培养液包括：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5~6.0。本专利技术取发酵液10mL，加甲醇40mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测洛伐他汀产量，可达154μg/mL~158μg/mL（附图10）。Av-2曲霉菌株5L发酵罐发酵80h~100h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中洛伐他汀，与滤液混合；用远藤章教授方法提取洛伐他汀，蒸干后得块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明发酵液中洛伐他汀提取物结构与洛伐他汀标准品一致。本专利技术所筛选的杂色曲霉（A.versicolor）Av-2菌株，具有高产洛伐他汀、培养简单等特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，Av-2曲霉菌株通过液体发酵培养和发酵条件优化后，5L发酵罐发酵培养80h~100h，洛伐他汀产量可达154μg/mL~158μg/mL（附图10）。用远藤章教授方法提取发酵液中的洛伐他汀，蒸干后得块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明洛伐他汀提取物结构与洛伐他汀标准品相一致。有关杂色曲霉（A.versicolor）产生洛伐他汀还未见有报道，所筛选的Av-2菌株是较有潜力的工业菌株。附图说明图1Lov本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高产洛伐他汀杂色曲霉（Aspergillus versicolor）Av‑2菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2016379，保藏日期为：2016年7月7日。

【技术特征摘要】
1.高产洛伐他汀杂色曲霉（Aspergillusversicolor）Av-2菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2016379，保藏日期为：2016年7月7日。2.权利要求1所述的杂色曲霉Av-2菌株用于发酵生产洛伐他汀中的应用。3.高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：1）用接种针挑少量权利要求1所述的菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；2）取平皿中1菌饼接种于一级种子培养液中，摇床培养3d，制得一级种子；3）在二级种子培养液中，按6%加入一级种子，200r/min摇床培养2d成二级种子；4）在5L发酵罐发酵培养液中按20%接入二级种子进行发酵培养；发酵时间为80h~100h；5）过滤发酵液，乙酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋冬花，许楚旋，寿碧栋，王志颖，张琪，江北，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33