一种3D打印生物墨水及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种3D打印生物墨水及其制备方法，所述3D打印生物墨水包括如下质量百分含量的原料制成：胞外囊泡混悬液10‑30％、生物大分子材料5‑15％、促溶剂0.1‑1％、余量水；利用胞外囊泡的优点、生物大分子材料与水凝胶本身的特点，更好的模拟细胞外基质成分、结构及生物活性特点。

A kind of 3D printing bio ink and its preparation method

The present invention discloses a 3D printing biological ink and its preparation method. The 3D printing biological ink includes the following raw materials with the following mass content: the extracellular vesicle suspension 10, the biological macromolecule material 5, 15%, the solvent 0.1 1%, the residual water, the advantage of the extracellular vesicles, the biological macromolecule material and the water. The characteristics of gel itself are better to simulate the components, structure and biological activity of extracellular matrix.

【技术实现步骤摘要】
一种3D打印生物墨水及其制备方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及3D生物打印
，尤其涉及一种3D打印生物墨水及其制备方法。
技术介绍
3D打印技术用于临床医疗的案例已不再罕见，该技术与医疗的结合方式主要有以下几种：①术前诊断及手术预演模型；②植入物制备(骨骼、牙齿、软组织器官等)；③外用医疗耗材(颌面塑形支具等)。目前硬组织支架如骨、牙齿的打印技术目前已较为成熟，但软组织支架的打印仍有待进一步完善。现有可供软组织打印的生物墨水多为高分子水凝胶，包括人工合成高分子材料及胶原等天然水凝胶：(1)合成凝胶如聚富马酸二羟丙酯(PPF)、聚D，L-丙交酯(PDLLA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚碳酸酯等作为打印墨水使用时成型速度快，但配制时需加入光敏树脂(主要由齐聚物、活性单体、光引发剂及其他助剂)，因此安全性尚需进一步谨慎评估；(2)包括“(1)”所列高分子在内的合成高分子材料，此外还包括聚氨酯(PU)、聚乙烯(PE)、聚丙烯酸酯(Acrylic)具有安全、易量产等优势，但部分材料存在化学残留，应用于3D打印生物墨水，存在可降解性不佳、或降解产物碎片毒性未知与生物活性并不理想等诸多问题；(3)天然水凝胶如明胶、明胶-壳聚糖、明胶-藻酸盐、藻酸盐等具有良好的生物相容性以及与人体软组织相似的生物力学性质。使用这些材料进行3D打印可获得大小在微米级别的彼此连通的孔隙结构。但围绕着这些材料开展的进一步研究结果显示；打印支架对细胞的分化促进作用较弱；接种于打印支架上的细胞在整个培养过程中都仅在原位生长，无法进一步与支架结合并降解支架。这些细胞与生物墨水、支架作用不良的问题，可能是由于现有制造技术(包括3D打印在内)的精度有限，无法重现ECM的拓扑结构所导致的(该结构对细胞的表型、功能具有至关重要的作用)。为了提高材料的活性仿生，目前的研究大都聚焦在将一或多种活细胞或生子掺入材料这两种策略之上。然而，含细胞材料的制备难度大，稳定性差，推广困难。而长因子对软组织损伤愈合的作用在体内外的表现并不一致，呈现出复杂性以及对浓度、时空协同性的依赖,不同因子可能作用于不同的细胞生长周期,一种生长因子又可以影响其他因子的表达和活性。因此,这种方法最终的效果往往不令人满意。
技术实现思路
针对以上存在的问题，本专利技术提供了一种3D打印生物墨水，利用胞外囊泡的优点、天然高分子与水凝胶本身的特点，更好的模拟细胞外基质成分、结构及生物活性特点。本专利技术的技术方案如下：一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：胞外囊泡混悬液10-30％；生物大分子材料5-15％；促溶剂0.1-1％；余量水。所述胞外囊泡混悬液是从异体/自体/异种来源的细胞、体液中提取得到的胞外囊泡悬浮于PBS缓冲液中制得。所述胞外囊泡是通过差速离心法、蔗糖密度梯度离心法、抗体标记的磁珠分选、微孔过滤技术、试剂盒提取法、微流控技术中的任一中方法提取得到。所述生物大分子材料所述生物大分子材料为动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，优选为猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，其主要成分为Ⅰ型,Ⅲ型以及Ⅴ型胶原，采用超低温粉碎研磨得到平均粒径低于30μm的颗粒。所述水为蒸馏水或超纯水。所述促溶剂为盐酸、磷酸、醋酸。所述3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：将生物大分子材料、促溶剂与水混合，搅拌至溶解完全，调节pH为6-7.45，加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，离心，得到3D打印生物墨水。本专利技术还提供了一种3D打印成型方法，包括如下步骤：(1)3D生物打印：利用3D打印机将3D打印生物墨水按照建好的数字模型，由10-50℃的墨水注射筒经针头打印到0-10℃的接收平台上；打印后，在0-10℃环境下储存5-120分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；(2)交联：定型的凝胶材料进行水洗；然后加入交联剂，于0-10℃的条件下交联反应0.5-48h；最后再进行水洗，洗去残余交联剂；所述交联剂为戊二醛、京尼平或碳酸二亚胺，所述交联剂的用量为3D打印生物墨水用量的0.1-0.5％。胞外囊泡是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成分，在细胞旁分泌中扮演重要角色。胞外囊泡内含有脂质、蛋白质(生长因子)、核酸(DNA、mRNA及microRNA、lncRNA、circRNA等noncodingRNA),可通过生物合成与内吞作用参与到精确而复杂的膜运输过程。在炎症免疫反应、细胞存活与凋亡、血管新生、血栓形成、自噬等生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用。胞外囊泡可于体外长时间保存而不丧失活性(-20～-80℃)，胞外囊泡内携带多种生物活性物质(蛋白及核酸),在细胞功能调控中占重要地位，获取过程较为简单，可大规模制备，低温保存(-20℃保存6个月)仍能保留其生物学功能。将胞外囊泡作为生物活性元件加入生物墨水，可避免含细胞材料的“质量可控”问题，胞外囊泡“集团”化释放多种活性因子促进修复，效果优于只结合一到两种生长因子的传统材料，可实现材料生物性能仿生的目标。生物墨水的重要成分是猪、牛或羊软组织尤其是真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，其主要成分为Ⅰ型及Ⅲ型胶原，保留了真皮内天然细胞外基质结构，成分及结构上本已具有仿生性，且这种仿生性无法通过将提纯的Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白混合，电纺、3D打印或其他制备手段实现。复合了胞外囊泡的生物墨水，可在0-30℃下储存并保持原有成分、微结构及生物活性，仅凭简单的温度调控既能快速成型，不含光敏物质，更为安全，更适用于在日用化工、科研、临床医学、转化医学中应用推广。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术将细胞分泌的胞外囊泡与动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉结合形成复合生物墨水，可用于制备成分、结构及活性仿生的3D打印仿生软组织替代物，可为不依赖细胞的皮肤生态微环境重建提供新策略，满足医疗卫生事业的巨大需求。2、本专利技术应用于3D打印的复合墨水材料重要原料之一纳米纤维微粉由猪、牛或羊软组织尤其是真皮软组织源性细胞外基质制成，这些材料有多年实验及临床应用经验，免疫原性低，安全性好，其保存了真皮外基质的主要蛋白成分及外基质纤维的拓扑结构，其在成分、结构上的仿生性无法通过将提纯的Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白混合，电纺、3D打印或其他制备手段实现。3、本专利技术中的复合墨水材料结合细胞外囊泡的优点，植入体内后可“集团式”释放多种活性因子，更好的促进修复。4、本专利技术提供的软组织3D打印生物墨水材料，通过3D打印技术，可以实现个体针对性，为不同的病人可以有不同的设计，符合临床上的需要。具体实施方式通过实施例的描述，对专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，目的是帮助本领域的技术人员对本专利技术的构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，并有助于其实施。实施例1一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：胞外囊泡混悬液10％猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉5％盐酸1％超纯水余量。所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠溶液调节pH为6.5,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，离心，即得生物墨水材料。3D打印成型方法，包括如下步骤：(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将复合墨水材料按照建好的数字模型，由1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3D打印生物墨水，其特征在于，包括如下质量百分含量的原料制成：胞外囊泡混悬液 10‑30％；生物大分子材料 5‑15％；促溶剂 0.1‑1％；余量水。

【技术特征摘要】
1.一种3D打印生物墨水，其特征在于，包括如下质量百分含量的原料制成：胞外囊泡混悬液10-30％；生物大分子材料5-15％；促溶剂0.1-1％；余量水。2.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述胞外囊泡混悬液是从异体/自体/异种来源的细胞、体液中提取得到的胞外囊泡悬浮于PBS缓冲液中制得。3.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述生物大分子材料为动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，优选为猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，李志勇，祁少海，陈永明，吴军，傅炀，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44