一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，包括ASFV‑反应液、DNA酶混合液、ASFV‑内标、ASFV‑阳性对照、ASFV‑阴性对照、核酸释放剂以及ASFV‑定量参考品，所述ASFV‑反应液包括：引物：ASF03F03和ASF03R03；内标引物：IPC05F01和IPC05R01；探针ASF03P和内标探针IPC05P；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段。本发明专利技术还公开了一种制备上述非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的方法以及使用其的检测方法。

A fluorescent PCR detection kit for African swine fever virus, preparation method and use method thereof

The present invention discloses a fluorescent PCR detection kit for African swine fever virus, including ASFV reactive liquid, DNA enzyme mixture, ASFV internal standard, ASFV positive control, ASFV negative control, nucleic acid releasing agent, and ASFV quantitative reference material. The ASFV reaction fluid includes: primers: ASF03F03 and ASF03R03; internal standard primers: IPC0 5F01 and IPC05R01; probe ASF03P and internal standard probe IPC05P; the primers and probes correspond to highly conserved fragments of the p72 gene of African swine fever virus. The invention also discloses a method for preparing the fluorescent PCR detection kit for African swine fever virus and a detection method using the same.

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法
本专利技术涉及动物病原分子诊断
，特别是指一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是猪的一种高度接触性传染疾病，病死率可达100％，由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起与传播。该病发展非常迅速，不到1个世纪的时间内，从非洲开始席卷至近乎整个世界。ASF已是一种严重危害“世界经济”的动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类动物疫病。目前我国虽然不是ASF疫区，但周边国家却疫情不断，因此对于ASF的防控已被相关部门提上紧急日程。今年4月，农业部再一次颁布关于进一步加强非洲猪瘟风险防范工作的紧急通知，可见我国ASF的防控刻不容缓。ASF通常表现急性病程，病猪往往在出现明显临床症状前就死亡。典型症状主要表现出血热、心跳与呼吸频率加速、呕吐腹泻、眼睑分泌物、远端肢体与胸腹部发红、厌食、精神萎靡等。感染动物会出现多器官病理损伤，主要包括淋巴结、肾、膀胱、脾脏、内脏黏膜出现出血点。上述ASF临床症状和病理同古典猪瘟CSF、猪皮炎与肾病综合征PDNS、蓝耳病PPRS比较类似，通过临川诊断和病理诊断很容易混淆，因此需要快速、可靠、特异、敏感的实验室检测技术辅助诊断。目前为止，ASF尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制。各国均采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。现有的检测方法存在操作复杂、易受环境影响、容易感染、不适于早期诊断且检测结果误差较大等缺点。因此，亟需一种快速而准确的诊断方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种能够快速而准确的用于非洲猪瘟病毒的早期检测的荧光PCR检测试剂盒、制备方法及使用方法。基于上述目的本专利技术提供的一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，包括ASFV-反应液、DNA酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品；其中，所述ASFV-反应液包括：引物：ASF03F03：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’和ASF03R03：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’；内标引物：IPC05F01：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’和IPC05R01：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’；探针：ASF03P：5’-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；内标探针：IPC05P：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段，所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。在其中一个实施例中，所述ASFV-反应液还包括缓冲液，所述缓冲液中，盐酸缓冲液的浓度为125～200mM。在其中一个实施例中，所述ASFV-反应液还包括脱氧核糖核苷，包括dATP、dUTP、dGTP以及dCTP。在其中一个实施例中，所述核酸释放剂包括25～100mM的氢氧化钠、1～5％的聚乙二醇和0.5～1mM的乙二胺四乙酸二钠。在其中一个实施例中，所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶与尿嘧啶-N-糖基化酶。在其中一个实施例中，所述ASFV-定量参考品包括4个浓度逐渐降低的重组质粒，所述重组质粒的核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。在其中一个实施例中，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：一种如上所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的制备方法，包括：选取ASFV基因组的p72基因中高度保守区域的序列，设计三组引物与探针，分别对所述三组引物与探针进行扩增，筛选扩增效率、探针信噪比以及扩增曲线形态最佳的一组，作为所述ASFV-反应液的引物与探针；合成编号为pUC-p72的重组克隆质粒，所述重组克隆质粒含有所述ASFV-反应液中引物的扩增产物的目标核苷酸序列，并用蛋白核酸测定仪对所述重组克隆质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组克隆质粒通过TE缓冲溶液进行稀释，得到浓度不同的多组重组克隆质粒，分别作为所述ASFV-阳性对照和所述ASFV-定量参考品；随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至pUC57载体上，形成编号为pUC-ipc的重组质粒，并根据所述重组质粒的序列合成多套内标引物与探针，分别将所述多套内标引物与探针加入p72扩增体系中进行扩增，筛选对p72扩增体系的荧光曲线和Ct值无干扰的一套，作为所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针；提供多组不同浓度的氢氧化钠溶液、聚乙二醇溶液，分别筛选背景荧光值、平台荧光值、Ct值以及曲线形态为最佳的氢氧化钠浓度以及聚乙二醇浓度，并与EDTA溶液混合，作为所述核酸释放剂。在其中一个实施例中，所述ASFV-反应液的引物与探针包括：引物ASF03F03-GATGATGATTACCTTYGCYTTG、引物ASF03R03-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT以及探针ASF03P-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb；所述编号为pUC-p72的重组克隆质粒的核苷酸序列为：GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG；所述ASFV-反应液的内标引物与内标探针包括：内标引物IPC05F-CACGGCTGAGAGAACATGGA、内标引物IPC05R-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT以及内标探针IPC05P-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1。一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，应用如上所述的试剂盒，检测方法包括：提供待测样品，所述待测样品选自死猪的肺、脾、肝以及淋巴结中的任一组织；或选自活猪的血液或扁桃体；对所述待测样品中的非血液成分进行预处理，研磨至匀浆并离心取上清液为待测样本；将试剂盒中除DNA酶混合液外的各组分溶解混匀，再加入DNA酶混合液制成PCR混合液；取PCR管或8联排管或96孔板作为试管，每支均加入核酸释放剂，再分别加入ASFV-阴性对照、ASFV-阳性对照以及待测样本，以及每支加入所述PCR混合液；分别将上述试管放入PCR仪扩增，依次进行一次50℃下尿嘧啶-N-糖基化酶反应2min,一次95℃下Taq酶活化5分钟,95℃下变性15秒，60℃下退火延伸30秒，采集荧光信号，进行40个PCR循环；根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果:待检测样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括ASFV‑反应液、DNA酶混合液、ASFV‑内标、ASFV‑阳性对照、ASFV‑阴性对照、核酸释放剂以及ASFV‑定量参考品；其中，所述ASFV‑反应液包括：引物：ASF03F03：5’‑GATGATGATTACCTTYGCYTTG‑3’和ASF03R03：5’‑CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT‑3’；内标引物：IPC05F01：5’‑CATAGTTGGACCGCTAGGA‑3’和IPC05R01：5’‑GAAAGGTCCCGCAAAGAGT‑3’；探针：ASF03P：5’‑Fam‑CCACGGGAGGAATAYCAAC‑Mgb‑3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；内标探针：IPC05P：5’‑Hex‑CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT‑Bhq1‑3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段，所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。...

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括ASFV-反应液、DNA酶混合液、ASFV-内标、ASFV-阳性对照、ASFV-阴性对照、核酸释放剂以及ASFV-定量参考品；其中，所述ASFV-反应液包括：引物：ASF03F03：5’-GATGATGATTACCTTYGCYTTG-3’和ASF03R03：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’；内标引物：IPC05F01：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’和IPC05R01：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’；探针：ASF03P：5’-Fam-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，Fam为报告荧光基团，Mgb为淬灭荧光基团；内标探针：IPC05P：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团；所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段，所述非洲猪瘟病毒p72基因的高度保守片段的扩增目标核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-反应液还包括缓冲液，所述缓冲液中，盐酸缓冲液的浓度为125～200mM。3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-反应液还包括脱氧核糖核苷，包括dATP、dUTP、dGTP以及dCTP。4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括25～100mM的氢氧化钠、1～5％的聚乙二醇和0.5～1mM的乙二胺四乙酸二钠。5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA酶混合液包括酶稀释液、热启动Taq酶与尿嘧啶-N-糖基化酶。6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-定量参考品包括4个浓度逐渐降低的重组质粒，所述重组质粒的核苷酸序列为:GATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATATCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTG。7.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：8.一种如权利要求1至7任一项所述的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：选取ASFV基因组的p72基因中高度保守区域的序列，设计三组引物与探针，分别对所述三组引物与探针进行扩增，筛选扩增效率、探针信噪比以及扩增曲线形态最佳的一组，作为所述ASFV-反应液的引物与探针；合成编号为pUC-p72的重组克隆质粒，所述重组克隆质粒含有所述ASFV-反应液中引物的扩增产物的目标核苷酸序列，并用蛋白核酸测定仪对所述重组克隆质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组克隆质粒通过TE缓冲溶液进行稀释，得到浓度不同的多组重组克隆质粒，分别作为所述ASFV-阳性对照和所述ASFV-定量参考品；随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至pUC57载体上，形成编号为pUC-ipc的重组质粒，并根据所述重组质粒的序列合成多套内标引物与探针，分别将所述多套内标引物与探针加入p72扩增体系中进行扩增，筛选对p72扩增体系的荧光曲线和Ct值无干扰的一套，作为所述ASFV-反应液的内标引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻正军，石建，杨磊，罗哲容，杨忠苹，李增强，
申请(专利权)人：湖南国测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43