芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法技术

本发明专利技术提供了一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。所述提取方法包括：使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解；所述酶解液由酶液与SCW液组成，所述酶液包括纤维素酶、果胶酶、甘露醇和CaCl2，pH为5.6；所述SCW液包括山梨醇、CaCl2和MES，所述SCW液的pH为5.8；向酶解产物中的上清液中加入W5溶液，离心取沉淀，向所述沉淀中加入含有MES的蔗糖溶液，离心取原生质体沉淀，再向其中加入W5溶液，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。本发明专利技术克服了提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的缺点，并且该方法融合效率比较高，原生质体仍能保持较高的细胞活性。

Extraction method of Protoplast from mustard and fusion method of protoplast of Brassica juncea hybrid

The invention provides a method for extracting mustard protoplasts and a method for the fusion of mustard hybrid protoplasts. The extraction method includes: enzymolysis liquid to hydrolyse the true leaf enzyme of sterile seedlings of mustard; the enzyme solution consists of enzyme liquid and SCW liquid, which includes cellulase, pectinase, mannitol and CaCl2, and pH is 5.6; the SCW solution includes sorbitol, CaCl2 and MES, the pH of the SCW solution is 5.8; the solution is in the supernatant of the enzyme hydrolysate. Adding W5 solution, centrifugation and precipitation, adding a sucrose solution containing MES to the precipitate, precipitating the Protoplast by centrifugation, then adding W5 solution and centrifugation to extract the chromatography solution, which is a solution containing the protoplast of the mustard. The invention overcomes the shortcomings of low volume of protoplast, easy rupture and unstable extraction effect during the extraction process, and the method has high fusion efficiency, and the protoplast still maintains high cell activity.

【技术实现步骤摘要】
芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法
本专利技术涉及十字花科蔬菜育种
，更具体地，涉及一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。
技术介绍
细胞质雄性不育是十字花科蔬菜杂种优势利用的主要途径。通常是利用不同来源的细胞质雄性不育源，通过杂交和多代回交，选育不育性稳定地细胞质雄性不育系为骨干材料，配制出综合性状优良的杂种一代。通过细胞质雄性不育系进行优势育种，克服了以往十字花科蔬菜采用自交不亲和系所带来的不亲和性难于保持、自交多代易发生双亲生活力衰退以及容易出现假杂种等弊端，但是往往由于核质互作不配套导致的后代植株表型上的不足，不能满足杂种一代的经济性状的要求，引起制种产量低，不利于芥菜新品种的推广。因此，探究利用新的技术手段(如细胞工程和生物技术)改良芥菜不良性状，有重要的理论和育种实践意义。芥菜起源于中国，由于芥菜花器官小，是常自花授粉作物，自交亲和性好，因此细胞质雄性不育系是芥菜杂种优势利用的主要途径。芥菜hauCMS是华中农业大学1999年发现的一种新的细胞质雄性不育类型，通过对芥菜hauCMS的不育性评价、线粒体不育基因的分子鉴定、不育基因克隆、转基因功能验证及线粒体基因组测序，明确了芥菜hauCMS是一种十字花科作物胞质不育新类型。本专利技术所采用的芥菜细胞质雄性不育系FanY-9A材料，是通过芥菜型油菜hauCMS与分蘖芥菜(雪里蕻)自交系杂交和回交，选育获得分蘖芥菜(雪里蕻)hau胞质雄性不育系。但是该杂交后代存在种荚弯曲畸形，不直立，导致后代结籽率不高，制种产量偏低。细胞融合是一种细胞工程技术，是一种细胞水平上对作物进行遗传改良的手段，是对传统育种技术的一种提升，可用于改良原有材料或创制新的种质材料。细胞融合技术将2个不同的材料进行细胞质和细胞核融合，可极大程度地缩短育种周期，增加杂种后代的多样性，育种工作者可以筛选大量高质量的原生质体获得期望的优良表型，但是提高细胞融合效率一直是该技术的关键问题。
技术实现思路
为了解决目前芥菜原生质体提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的问题，本专利技术的第一目的在于提供了一种芥菜原生质体的提取方法。该提取方法包括如下步骤：1)使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解，得到芥菜粗原生质体液；所述酶解液由体积比为3:(5-10)的酶液与SCW液组成，所述酶液包括0.3％-1.0％纤维素酶、0.05％-0.2％果胶酶、0.1M-0.5M甘露醇和70mM-80mMCaCl2；所述SCW液包括0.3M-0.8M山梨醇、8mM-15mMCaCl2和2mM-10mMMES；2)向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入W5溶液，离心后向沉淀中加入W5溶液重悬后加入到含有MES的蔗糖溶液中，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。其中，步骤1)中所述酶液包括0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、0.2M甘露醇和80mMCaCl2，所述酶液的pH为5.6；所述SCW液包括0.5M山梨醇、10mMCaCl2和5mMMES，所述SCW液的pH为5.8。在一个优选实施方式中，酶液与SCW液的体积比为3:7。其中，步骤1)中所述酶解的时间为14h～16h，优选为14h。其中，步骤1)中所述酶解的温度可以为25℃，酶解的转速为50～60rpm，转速优选为54rpm。其中，步骤1)中，所述酶解液的加入量以20～30片真叶加8-15mL酶解液为准。优选以20～30片真叶加10mL酶解液为准。其中，真叶的长优选约为15～20mm，宽约为7～10mm，厚约0.5mm～0.8mm。其中，步骤2)中所述W5溶液包括154mMNaCl、125mMCaCl2、5mMKCl和5mM葡萄糖，所述W5溶液的pH为5.8。其中，“向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入W5溶液”中粗原生质体液与W5溶液的体积比优选为1:1。其中，步骤2)中“向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入W5溶液，离心后向沉淀中加入W5溶液重悬”具体包括：向芥菜粗原生质体液中加入W5溶液，以转速为700-1000rpm/min离心5-10min，去掉上清液后再加入2mLW5溶液重悬，重悬后取沉淀。其中，含有MES的蔗糖溶液中蔗糖为0.5M，MES为1mM，所述含有MES的蔗糖溶液的pH为5.8。其中，含有MES的蔗糖溶液优选为5mL。其中，芥菜无菌苗的真叶的获取步骤优选为：用芥菜的种子通过组织培养获得无菌苗。优选选用在组织培养时第一到第三片真叶长成的时间取无菌苗真叶，通常在组织培养三周左右时取无菌苗的真叶，此时酶解效果最佳。其中，本专利技术提供的提取方法尤其适用于芥菜细胞质雄性不育系FanY-9A或芥菜细胞质雄性保持系FanY-9B。当芥菜为芥菜细胞质雄性不育系FanY-9A或芥菜细胞质雄性保持系FanY-9B时，芥菜无菌苗的真叶的获取步骤可以为：用芥菜细胞质雄性不育系FanY-9A或芥菜细胞质雄性保持系FanY-9B的种子，通过组织培养获得无菌苗。优选选用在组织培养时第一到三片真叶长成的时间取无菌苗真叶，通常在组织培养三周左右时取无菌苗的真叶，此时酶解效果最佳。本专利技术的第二目的在于提供了一种芥菜杂种原生质体的融合方法，该融合方法包括：将含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶液与含有芥菜细胞质雄性保持系原生质体的溶液等体积混匀，将混匀的原生质体溶液滴在PEG融合液中进行融合；所述含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶液由上述的提取方法提取得到；所述含有芥菜细胞质雄性保持系原生质体的溶液由上述的提取方法提取得到；所述PEG融合液包括10-20％PEG、60mM-70mMCaCl2、23-27mM甘露醇、20-30mM甘氨酸和8％-15％DMSO。在一个优选实施方式中，所述PEG融合液优选包括15％PEG、60mMCaCl2、25mM甘露醇、25mM甘氨酸和10％DMSO。其中，该提取方法还包括使用含有MES的W5溶液对融合后的产物逐步稀释后避光培养，所述含有MES的W5溶液中MES为30mM-80mM，所述逐步稀释中所述含有MES的W5溶液的用量呈梯度增加。其中，MES优选为50mM。其中，该提取方法还包括使用含有MES的W5溶液对融合后的产物逐步稀释后避光培养1.5h，所述含有MES的W5溶液中MES为50mM，所述逐步稀释中所述含有MES的W5溶液的用量呈梯度增加，每一次稀释的时间间隔为1min。在本专利技术一个优选实施方式中，该提取方法包括：将所述含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶液与所述含有芥菜细胞质雄性保持系原生质体的溶液的密度均调至2×106个/ml后等体积混匀，将所述PEG融合液按4×2或8×2滴滴入直径为6cm-9cm的培养皿中，将混匀的原生质体溶液滴加在每两滴所述PEG融合液间，避光培养10-30min后得到融合后的产物；使用含有MES的W5溶液将融合后的产物稀释5次后避光培养1.5-2h；每次所述MES的W5溶液的用量分别为0.125ml、0.25ml、0.375ml、0.5ml、1.0ml，其中，所述含有MES的W5溶液中MES为30mM-80mM；将培养后的产物离心，去上清即得到所述芥菜杂种原生质体。在本专利技术一个优选实施方式中，该提取方法包括：将所述含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芥菜原生质体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1)使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解，得到芥菜粗原生质体液；所述酶解液由体积比为3:(5‑10)的酶液与SCW液组成，所述酶液包括0.3％‑1.0％纤维素酶、0.05％‑0.2％果胶酶、0.1M‑0.5M甘露醇和70mM‑80mM CaCl2；所述SCW液包括0.3M‑0.8M山梨醇、8mM‑15mM CaCl2和2mM‑10mM MES；2)向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入W5溶液，离心后向沉淀中加入含有MES的蔗糖溶液，离心后再向沉淀中加入W5溶液，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。

【技术特征摘要】
1.一种芥菜原生质体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1)使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解，得到芥菜粗原生质体液；所述酶解液由体积比为3:(5-10)的酶液与SCW液组成，所述酶液包括0.3％-1.0％纤维素酶、0.05％-0.2％果胶酶、0.1M-0.5M甘露醇和70mM-80mMCaCl2；所述SCW液包括0.3M-0.8M山梨醇、8mM-15mMCaCl2和2mM-10mMMES；2)向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入W5溶液，离心后向沉淀中加入含有MES的蔗糖溶液，离心后再向沉淀中加入W5溶液，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述酶液包括0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、0.2M甘露醇和80mMCaCl2，所述酶液的pH为5.6；所述SCW液包括0.5M山梨醇、10mMCaCl2和5mMMES，所述SCW液的pH为5.8。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述酶解的时间为14h～16h，优选为14h。4.根据权利要求1至3中任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中，所述酶解液的加入量以20～30片真叶加入8-15mL所述酶解液为准。5.根据权利要求1至4中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述含有MES的蔗糖溶液中蔗糖为0.5M-1.0M，MES为0.5mM-2.0mM，所述含有MES的蔗糖溶液的pH为5.8。6.根据权利要求1至5中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述芥菜为芥菜细胞质雄性不育系FanY-9A或芥菜细胞质雄性保持系FanY-9B。7.一种芥菜杂种原生质体的融合方法，其特征在于，包括：将含有芥菜细胞质雄性不育系原生质...

【专利技术属性】
技术研发人员：万正杰，徐玉颖，王建科，姚培杰，刘旭佳，刘淑晶，杨媛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42