生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法技术

本文提供了用于指导人多能干细胞分化成内耳感觉上皮和感觉神经元的方法。更特别地，本文提供了用于获得包含以下的三维培养物的方法：人多能干细胞来源的耳前上皮、耳泡，以及含有毛细胞、感觉神经元和支持细胞的内耳感觉上皮。

Methods of developing inner ear sensory epithelium and sensory neurons in adults

This paper provides a method to guide the differentiation of human pluripotent stem cells into inner ear sensory epithelium and sensory neurons. More specifically, this article provides a method for obtaining the following three-dimensional cultures: human pluripotent stem cell sources of the auricular epithelium, auricular vesicles, and the inner ear sensory epithelium containing hair cells, sensory neurons and supporting cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年10月21日提交的美国临时申请No.62/244,568的权益，其通过引用如其全部内容所示并入本文。关于联邦资助研究或开发的声明本专利技术是在国立卫生研究院授予的DC015624、DC012617和DC013294的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
本文提供了用于指导人多能干细胞分化成内耳感觉上皮和感觉神经元的方法。更特别地，本文提供了用于获得包含以下的三维培养物的方法：人多能干细胞来源的耳前细胞上皮、耳泡、以及内耳感觉上皮，所述内耳感觉上皮含有毛细胞和支持细胞，以及支配感觉上皮的感觉神经元。
技术介绍
全世界有近5亿人患有听力损失，但并没有可以治疗听力损失的药理学、遗传学或细胞治疗。这种方法可用于生成人内耳干细胞、支持细胞、毛细胞和神经元以用于细胞治疗或用于药物发现。因此，本领域仍然需要用于使人多能干细胞分化成适用于临床细胞治疗的内耳感觉组织的高效的、可重复的、并且无异种材料的方法。
技术实现思路
在第一方面中，本文提供了获得人耳前上皮细胞的方法。如本文所述，所述方法包括：(a)在包含骨形态生成蛋白(BoneMorphogeneticProtein，BMP)和转化生长因子β(TransformingGrowthFactorBeta，TGFβ)信号传导抑制剂的培养基中培养人多能干细胞聚集体约8天至约10天；(b)在成纤维细胞生长因子(FibroblastGroMhFactor，FGF)和BMP信号传导抑制剂的存在下进一步培养(a)的经培养的聚集体约4天；和(b)使(b)的经进一步培养的聚集体接触Wnt激动剂约4天，由此经接触的聚集体内的细胞分化成耳前上皮细胞。FGF可以是FGF-2。BMP可以是BMP2、BMP4或BMP7。BMP信号传导抑制剂可以是LDN-193189。TGFβ1介导的信号传导的抑制剂可以选自SB431542和A-83-01。Wnt激动剂可以是GSK3抑制剂。GSK3抑制剂选自CHIR99021、氯化锂(LiCl)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。在另一个方面中，本文提供了获得包含人内耳感觉组织的三维组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将根据权利要求1所述的方法获得的人耳前上皮细胞包埋在包含细胞外基质蛋白的半固体培养基中；和(b)在促进包埋的耳前上皮细胞自组装成耳泡的条件下，在Wnt激动剂的存在下培养包埋的耳前上皮细胞约40天至约60天，由此获得包含人内耳感觉组织的三维组合物。Wnt激动剂可以是GSK3抑制剂，其中GSK3抑制剂选自CHIR99021、氯化锂(LiCl)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。细胞外基质可以是基底膜提取物(basementmembraneextract，BME)。三维组合物可以包含一种或更多种机械感觉细胞。三维组合物可以包含一种或更多种感觉神经元细胞。三维组合物可以包含一种或更多种与机械感觉细胞形成突触连接的感觉神经元细胞。在考虑以下附图、详细描述和所附权利要求后，将更好地理解本文描述的这些和其他特征、方面和优点。附图说明图1A至1N证实了用于逐步诱导听板样上皮的示例性方案。a，在听板颅区中的哺乳动物外胚层发育的概述。b，人耳诱导的关键事件的时间线。时间线上的第0天表示由hPSC表示的近似发育阶段：约12dpc。c，非神经外胚层(non-nerualectoderm，NNE)、耳-上鳃祖细胞区域(otic-epibranchialprogenitordomain，OEPD)和听板诱导的分化策略。括号内表示可能任选的或细胞系依赖的处理。d，经DMSO(对照)、10μMSB或10μMSB+10ng/mlBMP4(表示为SBB)处理的WA25细胞聚集体分化第2天的qPCR分析。将基因表达相对于未分化的hESC进行归一化；n＝3个生物样品，2个技术重复；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；误差线＝最大/最小值。e、f，经10μMSB或200nMLDN+10μMSB处理6天的WA25聚集体中的代表性TFAP2、ECAD和PAX6表达。g，经10μMSB+2.5ng/mlBMP4(SBB)处理的mND2-0iPSC在第6天的TFAP2、ECAD和PAX6表达。h、i，经SB处理的WA25聚集体在第8天的代表性图像：活的(h)和经PAX8和TFAP2抗体免疫染色的(i)。当比较图(h)和(i)中的形态时，注意到在冷冻切片过程期间外部上皮皱缩成聚集体核心。j、k，在第4天用50ng/mlFGF-2和200nMLDN(SBFL)处理后第8天，经SB处理的WA25聚集体的代表性图像：活的(j)和经PAX8和TFAP2抗体免疫染色的(k)。1至n，在第12天的的经SBFL处理的WA25聚集体。外部上皮包含PAX8+ECAD+细胞(1)和偶尔的PAX8+PAX2+听板样细胞的片(patch)(m、n)。所示出的样品在第8天用25μl额外的CDM处理。比例尺，100μm(e至m)，50μm(n)。图2A至2H证实了未分化的WA25hESC、细胞聚集和初始非神经外胚层分化分析。a、b，保持在E8培养基中的经玻连蛋白-N包被的平板上的WA25细胞表达激发的多能干细胞的标志物。c，分化策略和实验条件的概述。d、e，单细胞hESC的聚集在E8+20μMY-27632中比在CDM+20μMY-27632中产生更少的细胞碎片。f，相对于未分化的细胞，在除赋形剂对照以外的所有条件下，多能标志物在第2天显著下调。g，非神经标志物TFAP2和DLX3在SB和SBB条件下上调。h，中胚层标志物BRA和EOMES通过BMP4(B)处理上调。将基因表达相对于d0聚集体进行归一化。对于统计学检验，将处理值与对照(CTRL)值进行比较；n＝3个生物样品，2个技术重复；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns＝不显著；误差线是最大/最小值。比例尺，100μm(a、d、e)，25μm(b)。图3A至3G证实了使用WA25hESC的非神经诱导。a、b，分化策略的概述。c至e，培养中随时间推移的聚集体直径(c)和圆度(d)。随着外部上皮皱缩，聚集体的圆度随着时间推移而降低(e)。f、g，代表性的第4天聚集体显示出核心中几乎完全缺乏OCT4表达细胞、SOX2/ECAD表达细胞，以及在外部核心和上皮中几乎完全缺乏TFAP2/ECAD表达细胞。误差线是最大/最小值。比例尺，100μm。图4A至4R证实了Wnt信号传导激活启动包含前庭样毛细胞的内耳类器官的自组织和成熟。a，内耳类器官诱导策略。将第12天聚集体包埋在Matrigel液滴中以支持耳泡形成。b至d，在经CHIR处理的样品但不是DMSO(对照)样品中，耳凹样结构从外表皮外翻(d)。e至i，在第14天至35天之间，耳凹和耳泡表达耳特异性标志物，例如SOX10、SOX2、JAGl、PAX8、PAX2和FBXO2。在第35天，产生耳泡的上皮开始表达表皮角质形成细胞标志物KRT5(h)。j，到第40天至60天，聚集体包含多种类器官，并且通常，在DIC成像下可见到单个表皮单位。内耳类器官可以通过具有约25μm至40μm表观厚度和腔的确本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.获得人耳前上皮细胞的方法，其包括以下步骤：(a)在包含骨形态生成蛋白(BMP)和转化生长因子β(TGFβ)信号传导抑制剂的培养基中培养人多能干细胞聚集体约8天至约10天；(b)在成纤维细胞生长因子(FGF)和BMP信号传导抑制剂的存在下进一步培养(a)的经培养的聚集体约4天；和(b)使(b)的经进一步培养的聚集体接触Wnt激动剂约4天，由此经接触的聚集体内的细胞分化成耳前上皮细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.21 US 62/244,5681.获得人耳前上皮细胞的方法，其包括以下步骤：(a)在包含骨形态生成蛋白(BMP)和转化生长因子β(TGFβ)信号传导抑制剂的培养基中培养人多能干细胞聚集体约8天至约10天；(b)在成纤维细胞生长因子(FGF)和BMP信号传导抑制剂的存在下进一步培养(a)的经培养的聚集体约4天；和(b)使(b)的经进一步培养的聚集体接触Wnt激动剂约4天，由此经接触的聚集体内的细胞分化成耳前上皮细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述FGF是FGF-2。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP选自BMP2、BMP4和BMP7。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP信号传导抑制剂是LDN-193189。5.根据权利要求1所述的方法，其中TGFβ1介导的信号传导的抑制剂选自SB431542和A-83-01。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述Wnt激动剂是GSK3抑制剂。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述GSK3抑制剂选自CHI...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡尔·R·克勒，埃里·哈希诺，
申请(专利权)人：印第安纳大学研究与技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US