表达ETS转录因子的工程化的内皮细胞制造技术

在一些方面，本发明专利技术涉及工程化的内皮细胞，例如E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞。在其他方面，本发明专利技术涉及制备这种工程化的内皮细胞的方法，以及使用这种工程化的内皮细胞的方法，例如在共培养应用中。

Engineered endothelial cells expressing ETS transcription factors

In some respects, the present invention relates to engineered endothelial cells, such as E4ORF1+ETV2+ engineered endothelial cells. In other respects, the present invention relates to the preparation of such engineered endothelial cells and the use of such engineered endothelial cells, such as in co culture applications.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达ETS转录因子的工程化的内皮细胞相关申请的交叉引用本申请要求于2015年7月20日提交的美国临时专利申请No.62/194,466的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。参考引用为了仅允许通过引用并入的那些管辖权的目的，本公开中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。此外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商的说明书或目录，通过引用并入本文。通过引用结合到本文中的文件或其中的任何教导可以用于本专利技术的实践中。美国专利8,465,732中提供的许多一般教导可以与本专利技术结合使用，或者可以适用于本专利技术。因此，美国专利第8,465,732号的全部内容特此通过引用明确地并入本申请中。
技术介绍
转录因子(TF)的E-26(ETS)-家族中的一部分，包括ETV2(Lee等人，Cellstemcell,2:497-507(2008)；Sumanas等人，Blood,111:4500-4510(2008))，FLI1(Liu等，CurrentBio.18:1234-1240(2008))和ERG(McLaughlin等人，Blood,98:3332-3339(2001))涉及调节血管发育和血管生成(DeVal等人，DevCell,16:180-195(2009)；Sato等人，CellStructFunct,26:19-24(2001))。这些TF直接调节与内皮细胞(EC)发育和功能相关的基因的表达。成体EC表达几种ETS因子，例如FLI1，ERG(同种型1和2)、ETSJ、ETS2、Elfl、Elk1、VEZF和ETV6，而ETV2在胚胎发育期间瞬时表达，并且在成体EC中不存在(Kataoka等人，Blood,118:6975-6986(2011)；Lelievre等人，TheInternationalJournalOfBiochemistry&CellBiology,33:391-407(2001))。除了在发育过程中在血管规格中起关键作用(Liu等人，CircRes,103:1147-1154(2008)；Pham等人，DevBiol,303:772-783(2007))，也已表明这些TF中的一些的瞬时表达可将多能干细胞重编程为内皮细胞或可将其他(非多能)细胞类型重编程/转分化成内皮细胞(参见例如Choi等人，StemCells27,559-567(2009)，James等人，Nat.Biotech.28,161-166(2010)，Prasain等人，Nat.Biotech.32,1151-1157(2014)，Morita等人，PNAS,112,160-165(2015)，Kurian等人，Nat.Methods10,77-83(2013)，和Ginsberg等人，Cell,151:559-575)。然而，就本专利技术人所知，在本专利技术之前，ETS家族转录因子，特别是ETV2转录因子不被认为对分化的内皮细胞或已经定位于内皮细胞谱系的内皮细胞具有作用。类似地，在本专利技术之前以及就本专利技术人的最佳知识而言，也不预期表达此类因子的内皮细胞在其支持其他细胞类型，例如干细胞和祖细胞的扩增的能力方面可能具有增强的性质。腺病毒早期4(E4)区域含有至少6个开放阅读框(E4ORF)。之前已经显示了整个E4区域调节血管生成并促进内皮细胞的存活(参见Zhang等人(2004),J.Biol.Chem.279(12):11760-66)。先前也已经显示，在整个E4区域内负责内皮细胞中的这些生物效应的是E4ORF1序列。参见美国专利号8,465,732。另见Seandel等人(2008),“GenerationofafunctionalanddurablevascularnichebytheadenoviralE4ORF1gene,”PNAS,105(49):19288-93。
技术实现思路
本专利技术部分基于以下发现：ETS转录因子ETV2在内皮细胞中表达时具有某些意想不到的作用，特别是当ETV2与腺病毒E4ORF1多肽共表达时。虽然之前已知表达E4ORF1的内皮细胞即使在无血清的情况下也可长时间维持培养，并可用于支持其他细胞类型如造血干细胞和祖细胞(hematopoieticstemandprogenitorcells,HSPCs)的培养，(参见Kobayashi等人，NatureCellBiology12,1046-1056(2010)；Butler等人，Blood120,1344-1347(2012))，而现在发现表达E4ORF1和ETV2的工程化的内皮细胞(即E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞)也可以支持HSPC的扩增；此外，HSPC与E4ORF1+ETV2+内皮细胞的共培养物与单独使用E4ORF1+内皮细胞或单独使用ETV2+内皮细胞时观察到的相比能够获得更原始的HSPC群体选择性扩增。基于这些发现，本专利技术提供了E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞、包含这些细胞的组合物，以及产生和使用这些细胞的各种方法。在一个实施方式中，本专利技术提供了E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞的细胞群体，即表达腺病毒E4ORF1多肽和ETS转录因子多肽的工程化的内皮细胞的细胞群体。合适的ETS转录因子多肽包括FLI1、ERG(同种型1和2)、ETSJ、ETS2、Elf1、Elk1、VEZF、ETV6和ETV2。在优选的实施方式中，ETS转录因子是ETV2。因此，在一个优选实施方式中，本专利技术提供了E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞的细胞群体。在一些这样的实施方式中，工程化的内皮细胞包含编码所述分子的重组核酸分子，例如编码ETS转录因子多肽、或ETV2多肽或E4ORF1多肽的重组核酸分子。在一些这样的实施方式中，重组核酸分子是以质粒载体的形式。在一些这样的实施方式中，重组核酸分子被整合到工程化的内皮细胞的基因组DNA中。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体是分离的细胞群体。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体是基本上纯的细胞群体。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体在体外存在，例如在细胞培养物中。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体存在于体内，例如存在于活体内。在本专利技术的一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自分化的内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自成体内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞不是胚胎内皮细胞，或者不是源自胚胎内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自人内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自原代内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在一些实施方式中，本专利技术提供了包含本文所述的各种内皮细胞群的组合物。例如，在一个实施方式中，本专利技术提供了包含如本专利技术所述的工程化的内皮细胞的细胞群体的组合物。在一些实施方式中，这样的组合物可以包含载体溶液，诸如生理盐水溶液。在一些实施方式中，这样的组合物可以包含其他细胞类型，例如干细胞或祖细胞，包括但不限于造血干细胞或祖细胞(hematopoieticstemorprogenitorcells,HSPC)。在一些实施方式中，HSPC是遗传修饰的。在一些实施方式中，本专利技术提供的组合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞的细胞群体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.20 US 62/194,4661.E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞的细胞群体。2.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述细胞包含编码ETV2多肽的重组核酸分子。3.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述细胞包含编码腺病毒E4ORF1多肽的重组核酸分子。4.根据权利要求2或3所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述核酸分子是质粒载体的形式。5.根据权利要求2或3所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述核酸分子未整合到所述工程化的内皮细胞的基因组DNA中。6.根据权利要求2或3所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述核酸分子整合到所述工程化的内皮细胞的基因组DNA中。7.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述内皮细胞来源于分化的内皮细胞。8.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述内皮细胞来自成体内皮细胞。9.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述内皮细胞不是胚胎内皮细胞。10.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述内皮细胞是人内皮细胞。11.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述内皮细胞来源于原代内皮细胞。12.根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体，其特征在于，所述内皮细胞来自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。13.一种组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体。14.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，还包含载体溶液。15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述载体溶液是生理盐水溶液。16.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含干细胞或祖细胞。17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述干细胞或祖细胞是造血干细胞或祖细胞(HSPC)。18.一种治疗组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1所述的工程化的内皮细胞的细胞群体和适合施用于个体的载体溶液。19.根据权利要求18所述的治疗组合物，其特征在于，所述载体溶液是生理盐水溶液。20.根据权利要求18所述的治疗组合物，其特征在于，所述组合物还包含干细胞或祖细胞。21.根据权利要求20所述的治疗组合物，其特征在于，所述干细胞或祖细胞是HSPC。22.根据权利要求17所述的组合物或权利要求21所述的治疗组合物，其特征在于，所述HSPC获得自或源自骨髓。23.根据权利要求17所述的组合物或权利要求21所述的治疗组合物，其特征在于，所述HSPC获得自或源自外周血。24.根据权利要求17所述的组合物或权利要求21所述的治疗组合物，其特征在于，所述HSPC获得自或源自羊水。25.根据权利要求17所述的组合物或权利要求21所述的治疗组合物，其特征在于，所述HSPC获得自脐带血。26.根据权利要求18所述的治疗组合物，其特征在于，其用于细胞移植过程。27.根据权利要求18所述的治疗组合物，其特征在于，用于HSPC移植过程。28.一种在培养基中维持或扩增内皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将编码ETV2多肽的核酸分子和编码E4ORF1多肽的核酸分子引入内皮细胞，以产生E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞，其中，所述工程化的内皮细胞可以在培养基中维持或扩增。29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，进一步包括培养所述工程化的内皮细胞。30.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，进一步包括在不存在血清的情况下培养所述工程化的内皮细胞。31.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，进一步包括在不存在外源性生长因子的情况下培养所述工程化的内皮细...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·约瑟夫·诺兰，保罗·威廉·芬尼根，迈克尔·丹尼尔·金斯伯格，克劳德·杰弗里·戴维斯，
申请(专利权)人：安吉克莱茵生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US