含有蜘蛛丝蛋白质的丝线以及产生该丝线的蚕制造技术

使用通过利用转座子功能等方法，在不破坏蚕丝心蛋白Ｈ链基因的情况下导入了编码具有高强度、高伸长度等期望性质的蜘蛛丝蛋白质的基因的转基因蚕，使转基因蚕产生丝线的强度以及伸长度不下降且具有期望性质的蜘蛛丝蛋白质，从而生产具有期望性质的蜘蛛丝与丝线的复合丝。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过转基因蚕制备的含有蜘蛛丝蛋白质的丝线、该转基因蚕、以及通过该转基因蚕的丝线的制备方法。
技术介绍
在不影响强度和耐久性的同时，对于兼具重量轻以及柔软的材料或布的需求经常增加，而蜘蛛丝显示出具备很多期望的特性。已知织网蜘蛛能够通过6种不同类型的腺组织产生丝，这6种纤维各自具备不同的机械特性。由大囊状腺(Major amullate gland)和小囊状腺(Minor amullategland)形成的蜘蛛丝被称作牵引丝、drag line。因牵引丝显示出的高抗拉强度和高伸长度(非专利文献1)，期待其有广泛的工业用途(非专利文献2)。另外，由鞭毛状腺(Flagelliform gland)和聚状腺(Aggregate gland)形成的蜘蛛丝一般为横丝，显示粘着性和高伸长度(非专利文献3)。由此蜘蛛丝显示出比钢铁的抗拉强度还强以及具有比羊毛的抗屈曲性还强的特性，进一步地，已知其特征在于比KEVLAR(注册商标)具有更大的断裂能界限。特别地，牵引丝具有超过200ksi的抗拉强度，同时具有约35％的抗屈曲性。由于被赋予上述特征，蜘蛛丝能够作为重量轻的高强度纤维适用于多种织物。另外，由于蜘蛛丝在最高达100℃时仍稳定，使用该纤维能够加固热注入化塑料。该蛋白质即使呈膜或包衣的形态，也可能具有价值。进一步地，蜘蛛丝是以氨基酸为组成成分的蛋白质，兼具在自然界中可以被分解的优点。作为天然的蜘蛛丝蛋白质，已知有spidroin1(MaSpI)、spidroin2(MaSpII)(非专利文献4)、ADF-3、ADF4等。作为这些蜘蛛丝蛋白质具有的特征序列可例举如下，由丙氨酸、丝氨酸以及甘氨酸等占多数的氨基酸组成，同时，还含有相当多的谷氨酰胺、酪氨酸、亮氨酸以及缬氨酸等其他氨基酸。spidroin1含有重复序列，重复单位最大为34个氨基酸长度，而且不是严格保守。该重复单位由两个不同区段组成，即(i)由5-7个残基的多聚丙氨酸序列占多数的10个氨基酸区段，(ii)在序列内是保守的，但在许多重复单位中具有多次3个氨基酸缺失的24个氨基酸区段。后者的序列主要由Gly-Xaa-Gly基序组成，Xaa是丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺。Spidroin2也具有重复序列，重复单位最大为51个氨基酸长度，而且也不是严格保守。该重复单位由两个不同区段组成，即(i)由6-9个残基的多聚丙氨酸序列占多数的区段，(ii)包含GlyGlyTyrGlyProGly或GlyProGlyGlnGln氨基酸序列的区段。已发现作为天然蜘蛛丝蛋白质特别是牵引丝的主要组成蛋白spidroin1是包含甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸和缬氨酸作为组成成分的多肽。作为次要组成成分的spidroin2的序列中，已发现较spidroin1含有更多的脯氨酸，脯氨酸有助于转角构型和螺旋构型。已知作为保持上述特征的经人工合成、设计的基因包括DP-1B、DP-2A(非专利文献4)。但是，蜘蛛的集团饲养存在困难，直接从蜘蛛制备大量的丝存在困难。另外，天然蜘蛛丝的溶解和纯化也尚存困难，蜘蛛丝除了在例如LiSCN、LiClO4或88％(体积/体积)甲酸那样的非常苛刻试剂之外呈不溶性。即使一旦溶解，但是，进行透析时或者使用典型的缓冲液进行稀释时，构成蜘蛛丝的蜘蛛丝蛋白质还是沉淀。进一步地，通过蜘蛛制备的蜘蛛丝因蜘蛛丝的种类不同其性质有差异，分离得到具有期望性质的蜘蛛丝蛋白质更加困难。正因如此，以适当的花费利用天然来源获得商业有用量蜘蛛丝蛋白质是不可能的。因此近年来利用基因重组技术，尝试对多种生物进行改造以制备蜘蛛丝蛋白质。例如，尝试通过大肠杆菌或酵母等微生物制备蜘蛛丝蛋白质(非专利文献4)(专利文献1)、尝试利用烟草或马铃薯等植物(非专利文献5)、利用哺乳类细胞的方法、利用转基因山羊自乳汁或尿液生产的方法(专利文献2)等。但是，通过上述基因重组体产生蜘蛛丝蛋白质时，需要对产生的蜘蛛丝蛋白质进行提取、纯化、人工纺丝(非专利文献1)，人工纺丝需要耗费工时和费用，而且使用多种溶剂引发了环境负荷的问题。上述中、纯化和/或人工纺丝步骤并非必要，作为用于直接生产含有蜘蛛丝组成蛋白纤维的方法，公开了利用转基因蚕生产含有绿色荧光蛋白与蜘蛛丝蛋白质的重组蛋白的丝线(非专利文献3)。该方法通过电穿孔方法向蚕卵导入编码模拟绿色荧光蛋白与蜘蛛丝蛋白质的融合蛋白的基因，通过同源重组获得重组体。但是该方法中，与非转基因蚕所产的丝线相比，该方法只能生产出强度和伸长度低的丝线。作为该原因，考虑有以下可能性，1.由于通过同源重组导入基因，蚕本身持有的一对丝心蛋白H链基因中至少之一遭到破坏；2.为了挑选重组体，必须使绿色荧光蛋白作为融合蛋白表达，蜘蛛丝蛋白质的性质可能受损；3.所设计的蜘蛛丝蛋白质为不具有高强度、高伸长度特性的序列。特表平8-511426号公报特表2002-506642号公报国际公开第02/40528号公报Science，2002年，第295卷，p472-476Nature，2001年，第410卷，p541-548大崎茂芳，蜘蛛丝的化学，有机合成化学，(日本)，1985年，第4卷，第9号，p828-835Reviews in Molecular Biotechnology，2000年，第74号，p105-119Nature，2001年，第19卷，p573-577专利技术公开专利技术欲解决的课题本专利技术的课题是通过不使用多种溶剂并且不必进行人工纺丝步骤的方法而提供具有预期的高强度、高伸长度特性的蜘蛛丝的丝线。解决课题的手段本专利技术者们通过深入研究得到解决上述课题的方法，发现通过利用转座子的功能，使导入编码蜘蛛丝蛋白质基因的转基因蚕生产出具有预期高强度、高伸长度性质的含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，从而完成了本专利技术。即本专利技术提供以下(1)至(26)项专利技术。(1)含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，其是通过具有一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕制备的。(2)含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，其特征在于通过具有一对丝心蛋白H链基因的转基因蚕制备，基本保持丝线丝心蛋白H链蛋白的基本结构。(3)上述专利技术(1)或(2)所述的丝线，其特征在于蜘蛛丝蛋白质在丝心蛋白蛋白质中分散存在。(4)上述专利技术(1)至(3)中任意一项所述的丝线，其特征在于蜘蛛丝蛋白质与包含于丝心蛋白H链蛋白质中的多肽融合。(5)上述专利技术(4)所述的丝线，其特征在于蜘蛛丝蛋白质插入至丝心蛋白H链蛋白质的N末端部分与C末端部分之间，通过包含于C末端部分的半胱氨酸与丝心蛋白L链蛋白质形成二硫键。(6)上述专利技术(1)至(5)中任意一项所述的丝线，其特征在于蜘蛛丝蛋白质的含量为0.1％至25％重量百分比。(7)上述专利技术(6)所述的丝线，其特征在于蜘蛛丝蛋白质的含量为1％至15％重量百分比。(8)上述专利技术(7)所述的丝线，其特征在于蜘蛛丝蛋白质的含量为1％至10％重量百分比。(9)上述专利技术(1)至(8)中任意一项所述的丝线，其特征在于蜘蛛丝蛋白质包含序列编号1的肽或者包含在序列编号1中具有一个或多个氨基酸缺失、替换或添加并具有蜘蛛丝蛋白质特性的肽。(10)上述专利技术(9)所述的丝线，其特征在于包含上述专利技术(9)所述的肽重复3至30次的蜘蛛丝蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有蜘蛛丝蛋白质的丝线，特征在于：其是通过具有一对丝心蛋白Ｈ链基因的转基因蚕制备的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：平松绅吾，森山裕充，浅冈良太，守田健，田中贵，山田胜成，JP奥布莱恩，S法内施托克，
申请(专利权)人：东丽株式会社，纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]